组织蛋白酶 C（Cathepsin C,CTSC）,又称作二肽基肽酶 Ⅰ（Dipeptidyl peptidase I,DPPI）,是主要存在于溶酶体中的一种半胱氨酸蛋白酶,属于番木瓜蛋白酶超家族。它广泛存在于细菌、病毒、原生动物、真菌以及哺乳动物和植物中。CTSC在机体不同组织的生理、病理过程中发挥着非常重要的作用,包括细胞内蛋白质降解、细胞生长、神经氨酸酶激活和血小板因子ⅩⅢ激活等等。近年来陆续开展了水生动物CTSC的研究,发现其在机体抗病免疫反应中发挥重要作用。但是,关于硬骨鱼类CTSC如何参与机体抗细菌免疫的机制尚不清楚。鉴于此,本研究以中国南海主要的深水网箱养殖鱼类卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）为研究对象,克隆并鉴定了卵形鲳鲹组织蛋白酶C（TroCTSC）基因,并对其序列结构及抗菌免疫的功能进行了初步研究。主要实验内容以及结果如下:1.克隆获得了 TroCTSC,其编码区长度为1368 bp,编码455个氨基酸,分子量为50.79 kDa,理论等电点为6.27。氨基酸序列分析表明,N端的第1至第20个氨基酸为信号肽序列;第224至第450个氨基酸为木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶的结构域,其中包含3个活性位点,分别为Cys251、His397和Asn419。同源性比对结果显示TroCTSC与其他物种CTSC具有较高的同源性,为61.01%～90.77%。其中,与高体鰤同源性最高,高达90.77%;同源性最低的为非洲爪蟾（62.25%）;与人（60.93%）和小鼠（61.01%）也有较高的同源性。系统进化树分析结果显示,TroCTSC属于硬骨鱼类的一个分支,与同属于鲹科的高体鰤聚成一个分支,亲缘关系最近。2.通过对TroCTSC在健康条件下和细菌刺激后免疫组织的mRNA水平表达进行实时荧光定量PCR分析,发现TroCTSC在健康卵形鲳鲹的11个组织中均有表达,包括皮肤、心脏、肌肉、胃、脾脏、肠、头肾、鳃、肝脏、脑和血,其中血液的表达量最低,将其设置为1,最高表达量的肌肉组织约为59.2倍,其次是肝脏约为33.5倍。哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）感染卵形鲳鲹后,TroCTSC在脾脏、头肾和肝脏中的表达显著上调,其中在感染9 h后肝脏和头肾的表达量达到峰值,脾脏的表达量在感染12 h后达到峰值。说明TroCTSC广泛存在于卵形鲳鲹的各种组织中,在免疫器官中的高表达,提示TroCTSC可能参与机体的抗菌免疫反应。3.为了研究TroCTSC参与机体抗细菌免疫的机制,首先对TroCTSC在细胞中的定位进行了分析。结果显示,在卵形鲳鲹吻细胞（GPS）中TroCTSC主要分布在细胞质,部分存在于细胞质的溶酶体中。进一步研究发现,哈维氏弧菌刺激可促使TroCTSC从细胞质迁移至细胞核,表明细菌刺激可激活TroCTSC发生核易位,从而发挥其功能。4.基于TroCTSC活性位点的分析,成功构建了针对其保守催化活性位点的三个突变体,并诱导表达了 TroCTSC以及三个突变体的的融合蛋白rTroCTSC、rTroCTSC-C251A、rTroCTSC-H397A 和 rTroCTSC-N419A。体外酶活实验使用 CTSC特异性底物（Gly-Phe-β-naphthylamide）,结果表明,rTroCTSC的最适pH和温度分别为5.5和40℃。金属离子毒性实验表明,Ca2+、Zn2+能够明显促进rTroCTSC的酶活性,Fe2+和Cu2+能抑制rTroCTSC的酶活性,而Mn2+和Mg2+对rTroCTSC酶活性没有显著抑制或促进作用。与rTroCTSC相比,rTroCTSC-C251A、rTroCTSC-H397A和rTroCTSC-N419A的活性显著降低,表明该活性位点对TroCTSC发挥功能至关重要。5.运用活体实验进一步分析了 TroCTSC参与机体抗细菌免疫的效应。结果表明,当鱼体过量表达TroCTSC后感染哈维氏弧菌,过量表达组在脾脏、头肾和肝脏组织中细菌的数量显著低于对照组,显著提高了机体的抗菌能力。与此相一致的是,当鱼体中干扰表达TroCTSC后,干扰表达组在脾脏、头肾和肝脏组织中细菌的数量显著高与对照组。对免疫相关基因表达研究还发现,TroCTSC过量表达可显著上调各种促炎症细胞因子的mRNA水平,包括IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8,说明TroCTSC可增强机体的抗细菌感染能力。综上所述,本研究克隆并鉴定了卵形鲳鲹TroCTSC,并对其抗细菌免疫进行了研究。结果表明TroCTSC在宿主调节炎症反应、抵抗细菌感染和增强抗菌免疫反应的能力方面具有非常关键的作用,三个活性位点Cys251、His397和Asn419影响TroCTSC酶活。研究结果对进一步了解卵形鲳鲹抗病机制具有重要意义,也为卵形鲳鲹养殖业的绿色健康可持续发展提供了理论基础。