研究背景：Graves病(Graves’ disease, GD)是一种伴随甲状腺激素分泌增多的自身免疫性甲状腺疾病,甲状腺肿大、高代谢症候群和Graves眼病是其典型的临床特点。GD患者体内免疫功能紊乱,存在异常增高的TSH受体抗体(TRAb), TRAb是一组淋巴细胞分泌的多克隆抗体,可与TSH受体不同位点结合,当TRAb中兴奋性抗体(TSAb)与甲状腺细胞TSH受体结合时,激活腺苷酸环化酶信号系统,导致甲状腺细胞过度增生和甲状腺激素合成分泌增加,从而引起甲状腺肿大和甲状腺功能亢进。GD疾病过程中“甲状腺细胞过度增生”与细胞增殖机制异常相关。近年来研究表明除了TRAb外,其它细胞增殖相关分子(IGF-1、NF-κB、cyclin D1、 PCNA)在GD甲状腺肿大过程中起着重要作用。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一种在细胞生长和增殖中发挥重要作用的多肽。我们前期研究现IGF-1通过真核细胞转录因子(NF-κB)通路,上调cyclin D1的表达,促进大鼠甲状腺细胞增殖。NF-κB是一种细胞转录因子,参与多种基因的转录调控,调控细胞增殖、细胞分化等过程。Cyclin Dl是一种重要的细胞周期蛋白,调控细胞周期从期G1进入S期。增殖细胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助蛋白,参与细胞周期S期DNA合成。“免疫紊乱”是GD的诱发因素。近年来研究来表明GD患者存在T(淋巴)细胞亚群的异常,抑制性T细胞(Ts)功能缺陷,辅助性T细胞(Th)不适当致敏,使B(淋巴)细胞产生TRAb。T细胞根据细胞膜表面CD分子划分成不同的亚群。CD3分子仅存在于T细胞表面,因此主要用于标记成熟的T细胞。成熟的T细胞按照其表面CD分子的不同,又可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞主要是Th; CD8+T细胞主要是Ts和细胞毒性T细胞(CTL)；两者的比值CD4+/CD8+反映体内免疫功能状态。调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)是体内一类表型特征均为CD4+CD25+Foxp3+T细胞,它能够分泌IL-10和TGF-β,对T、B细胞具有抑制作用。近年来研究发现调节T细胞在GD的发生发展中起着重要作用。在过去的20年中,抗甲状腺药物(例如他巴唑、丙硫氧嘧啶、甲亢平)是非难治疗性GD病最常见的治疗方式,存在高复发率、治疗周期长、对巨大甲状腺肿疗效不明显的缺点。目前临床上对GD发病过程中关键环节“甲状腺细胞增殖”和“免疫紊乱”,缺乏针对性的药物。薯蓣皂苷元(Diosgenin, Dio),是一种天然来源的甾体皂苷元,以皂苷的形式主要存在于中药穿龙薯蓣的根茎中。在过去的三十年中,Dio被用于治疗或预防多种疾病,例如肿瘤、糖尿病、肥胖、血脂异常等。Moalic等报道Dio具有在体内外抑制多种实体肿瘤及白血病细胞系生长的作用,这种抗肿瘤的机制涉及到对增殖、凋亡、脂代谢及COX/LOX通路等的调节。Dio是合成各种甾体类药物的前体化合物,作为一种类固醇,其对免疫功能具有广泛的作用,具有促进TNF-α分泌,抑制IgE产生,上调调节性T细胞等作用。在传统中医民间验方的应用中,穿龙薯蓣被用于甲状腺瘤和甲状腺功能亢进的治疗。有中医药研究者报道穿龙薯蓣对免疫性大鼠甲状腺肿大有治疗作用。在前期的研究中我们报道了Dio能够引起甲状腺细胞细胞周期G0/G1的阻滞,降低cyclin D1表达从而抑制IGF-1诱发的人甲状腺原代细胞增殖。上述研究发现,提示我们Dio可能是一种对GD有治疗作用的药物,特别是在抗增殖和调节免疫方面。基于上述研究现状,在本研究中,我们应用了一个表达TSH受体A亚单位的重组腺病毒(Ad-TSHR-289)诱导的GD模型小鼠,该模型能非常有效地模拟人类GD病的发病过程。我们拟通过动物体内实验来研究Dio对GD的治疗作用。目的：1.评价Dio对Ad-TSHR-289诱导GD模型小鼠甲状腺肿大的治疗作用；从抑制细胞增殖的角度,初步探讨其分子生物机制。2.研究Dio对Ad-TSHR-289诱导GD模型小鼠免疫功能的影响。研究方法：1.动物模型构建及药物干预具体分组如下：正常对照组,正常小鼠高剂量Dio干预组(100mg·kg-1·day-1),阴性病毒对照组,GD模型组,GD模型低剂量Dio治疗组,GD模型高剂量Dio治疗组。应用重组腺病毒Ad-TSHR-289,肌肉注射免疫雌性BALB/c小鼠,每隔3周注射一次,共3次,制备GD动物模型。成模后的小鼠分别给予高、低剂量的Dio治疗。Dio治疗12和24天后,分两批次处死小鼠,留取血清、甲状腺、脾脏标本。2.Dio治疗过程中毒副作用的初步评估处死称量前体重,采用全自动生化分析仪检测血清中的谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(Cr)。3.Dio对GD模型小鼠甲状腺肿大治疗作用评价采用放射免疫法和电化学发光法测TT4和TRAb变化；Image-Pro Plus6.0图像分析软件测量甲状腺大小；H&E染色及电子显微镜观察甲状腺组织及超微结构变化。4.Dio抑制甲状腺细胞增殖相关机制研究采用BrdU掺入实验检测小鼠甲状腺组织中增殖细胞的变化；免疫组化检测Dio干预后小鼠甲状腺组织中IGF-1、NF-κB、cyclin D1、PCNA蛋白水平的变化；Real-time PCR检测Dio干预后小鼠甲状腺组织中IGF-1、cyclin D1、PCNAmRNA水平的变化。5.Dio对免疫功能的影响流式细胞仪检测Dio干预后小鼠脾细胞CD3、CD4、CD8、调节性T细胞的变化。结果：1.Dio对正常小鼠及GD模型小鼠的体重、AST、ALT、Cr均没有显著性影响。2.TT4和TRAb的变化：与正常对照组相比,GD模型组出现明显的TT4和TRAb增高(P<0.05)；与GD模型组相比,24天高、低剂量Dio治疗能明显降低GD模型小鼠血清中增高的TT4水平(P<0.01),这种降低存在剂量依赖性。24天的高、低剂量Dio治疗并不能降低GD模型小鼠增高的TRAb水平。3.甲状腺大体照片观察,12或24天的Dio治疗能明显缓解GD模型小鼠的甲状腺肿大。Image Pro-Plus6.0图像分析软件进一步的测定甲状腺截面积(代表甲状腺大小)。与正常组相比,GD模型组甲状腺截面积明显增大(P<0.01)；与GD模型组相比,高、低剂量Dio治疗组甲状腺面积均明显缩小(P<0.05),这种作用存在剂量依赖性。4.H&E染色发现,GD模型组甲状腺增生明显,滤泡上皮细胞成立方状或高柱状,排列紧密,增生向滤泡腔内形成乳头状突起,滤泡形态不规则,滤泡内胶质明显减少。GD模型Dio治疗组上述增生改变明显缓解。5.电子显微镜结果示,GD模型组甲状腺细胞合成分泌功能活跃,电镜下线粒体增多,体积增大,形状不规则；粗面内质网发达,池扩张,与线粒体相互缠绕；核膜凹陷,形状不规则；胞质内见大量的内吞胶质滴。GD模型高剂量Dio治疗组甲状腺上述改变均得到缓解。6.BrdU标记甲状腺增殖细胞结果示：与正常对照组组相比,GD模型组甲状腺内的增嫡细胞明显增多(P<0.01)。与GD模型组相比,24天的高、低剂量Dio治疗能明显减少GD模型甲状腺内的增殖细胞(P<0.05)。7.免疫组化结果示：与正常对照组相比,GD模型组甲状腺内IGF-1、 NF-κB、cyclin D1、PCNA蛋白水平的表达增加(P<0.05)；与GD模型组相比,24天的高、低剂量Dio治疗组甲状腺内IGF-1、NF-κB、cyclin D1、PCNA蛋白水平的表达降低(P<0.05),这种作用存在剂量依赖性。8. Real-time PCR结果示,与正常对照组相比,GD模型组甲状腺内IGF-1、 cyclin D1、PCNA mRNA水平的表达增加(P<0.01)；与GD模型组相比,24天的高、低剂量Dio治疗能明显降低GD模型小鼠甲状腺内IGF-1、cyclin D1、 PCNA mRNA水平的表达(P<0.05),这种作用存在剂量依赖性。9.流式细胞仪检测发现,Dio对小鼠脾细胞中淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、 CD8+、CD4+/CD8+)无明显影响作用。与正常对照组相比,GD模型组脾细胞中调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+T cells)百分率降低(P<0.05)；与GD模型组相比,GD模型高剂量Dio治疗组脾细胞中调节性T细胞百分率增加(P<0.05)。结论：1.Dio具有缓解Ad-TSHR-289诱导GD模型小鼠甲状腺肿大的治疗作用；在治疗过程中未发现Dio对体重、肝肾功有明显的影响作用。2.Dio缓解甲状腺肿大的作用机制与抑制甲状腺细胞增殖有关,并不依赖于TRAb,其中涉及到对增殖相关分子(IGF-1、NF-κB、cyclin D1、PCNA)表达的抑制。3.Dio能够纠正Ad-TSHR-289诱导GD模型小鼠脾细胞中调节性T细胞下降的异常。