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研究背景:胆囊癌(Gallbladder cancer,GBC)是全球最常见的胆道恶性肿瘤,但是目前尚无确切的分子靶向治疗方法。长链非编码RNAs(Long noncoding RNAs,lncRNAs)在肿瘤中通常表达失调,并与肿瘤的发生、发展密切相关。MicroRNAs(miRs,miRNAs)充当致癌或抑癌基因,在许多人类癌症的发展中起关键作用。最近发现在胆囊癌组织中microRNA(miR)-335的表达明显下调,但其具体作用的分子机制仍不清楚。此外,lncRNA NEAT1在胆囊癌中的异常表达是否与肿瘤进展相关尚不清楚,其促癌作用的机制尚需进一步明确。目的:(1)阐述miR-335在胆囊癌中下调的作用机制。(2)明确lncRNANEAT1调控Survivin可能的信号通路。(3)筛选并建立有效的针对Survivin及其调控因子的联合靶向基因治疗策略。方法:(1)收集人胆囊癌组织标本(n=25)和建立人胆囊癌细胞株(GBC-SD和SCG-996)。(2)完成RNA提取,并利用qRT-PCR检测miR-335表达。(3)Western blot实验分析胆囊癌细胞中Survivin的表达情况。(4)完成胆囊癌细胞系的转染,慢病毒载体的构建和感染。(5)利用生物信息学数据库和软件预测靶基因,萤光素酶报告基因实验进行验证。(6)细胞克隆形成试验和细胞计数Kit-8(CCK-8)检测细胞增殖。(7)Transwell实验检测细胞侵袭和转移能力。(8)裸鼠成瘤实验和IHC分析,检测miR-335在体内对GBC细胞功能的影响。(9)统计学分析:结果以 means±SD 表示。采用 GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)进行统计分析,对于两组间的比较使用Mann-Whitney检验,两组以上的比较采用ANVOA方差分析后行Tukey HSD检验。各因素间的相关分析采用Spearman秩相关系数检验。结果:(1)在胆囊癌组织中lncRNANEAT1和Survivin表达上调,而miR-335表达明显下调。(2)过表达miR-335可抑制胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭。(3)lncRNA NEAT1与miR-335具有相同的功能性结合位点,而Survivin是miR-335的直接下游靶基因。(4)敲低lncRNA NEAT1可竞争性的“海绵”miR-335,从而调控Survivin的表达。(5)lncRNA NEAT1的表达下调在体外可抑制胆囊癌细胞的增殖和侵袭,在体内可抑制肿瘤的生长。(6)miR-335是通过NEAT1/miR-335/Survivin轴促进胆囊癌细胞的增殖和转移。(7)lncRNA NEAT1的表达水平与miR-335呈负相关,但与Survivin呈正相关。结论:过表达miR-335可抑制胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭。lncRNANEAT1是通过竞争性地“海绵”miR-335调控Survivin的表达,从而在体外促进胆囊癌细胞的增殖和侵袭,在体内促进肿瘤的生长。此外,lncRNA NEAT1表达上调与miR-335表达呈负相关,但与Survivin表达呈正相关。