细菌性食物中毒是影响食品安全的一个非常重要的因素。副溶血性弧菌(VP)是一种嗜盐性细菌，通常存在于近海海水、海底沉积物、浮游生物、海产品(鱼类和贝类)及腌渍食品中，是夏秋季沿海地区引发食物中毒的首要病原菌。人多因食入未煮熟的海产品或污染此菌的盐渍食物而感染，潜伏期为2～26 h，最短仅1 h；主要症状为腹痛、腹泻、呕吐和发热等，粪便为水样，少数呈血水样或粘液血便。如果不及时治疗，可能会危急生命。 免疫传感器是由生物学、医学、物理、化学和电子学等学科相互渗透所形成的新研究领域，其在食品安全快速检测、临床医学、环境监测和军事等领域都有重要应用。凭借其微型化、低成本、特异性强、灵敏度高、检测快速方便和容易实现在线检测等优点，免疫传感器已成为当前的研究热点。抗原/抗体固定化技术是研究和开发免疫传感器最为关键和重要的工作。 本论文主要围绕以下几个方面开展了一些工作： 1.副溶血性弧菌抗原与抗体的制备 本实验成功制备了副溶血性弧菌抗原与抗体，平板计数得抗原浓度为10<10> cfu/mL，抗原形态学表征与文献报道一致；通过微量滴定凝集法测得抗体效价为128。实验结果表明，副溶血性弧菌抗原与抗体都具有良好的生物活性和特异性，这为后续工作的顺利开展奠定了基础。 2.电极预处理与表征 本实验对玻碳电极和丝网印刷电极进行预处理，通过形态学表征和电化学表征验证预处理效果。实验结果表明，电极预处理达到了预期效果，玻碳电极和丝网印刷电极都具有较好的一致性和重现性，这为后续实验的顺利开展奠定了基础。 3.基于壳聚糖金胶和丝网印刷电极的副溶血性弧菌电流型酶免疫传感器的研制 本实验将anti-VP掺杂于壳聚糖金胶中，并修饰于丝网印刷电极表面，从而制备一次性副溶血性弧菌免疫传感器。实验中采用循环伏安法和激光扫描共聚焦显微镜表征免疫传感器。采用夹心法检测VP，免疫传感器先在待测样品中室温孵育30 min，然后在HRP-anti-VP溶液中室温孵育30 min。采用循环伏安法监测酶促反应，通过免疫反应结合于免疫电极表面的HRP-anti-VP能够催化硫堇和过氧化氢，利用还原电流的增大来测定样品中的VP。在优化的免疫反应条件及电化学检测条件下，设定判定标准如下：△i<0.1μA为阴性；△i≥0.1μA为阳性。该免疫电极具有较好的特异性、重现性(RSD<9％)、稳定性(一周后电流响应为初始值的87％)和准确性(与EIJSA符合率为95％)。因此，该免疫传感器可初步用于VP的快速筛检。 4.基于琼脂糖/纳米金膜和丝网印刷电极的副溶血性弧菌电流型酶免疫传感器的研制 本实验将HRP-anti-VP掺杂于琼脂糖和纳米金中，并修饰于丝网印刷电极表面，从而制备一次性副溶血性弧菌免疫传感器。实验中采用循环伏安法和激光扫描共聚焦显微镜表征免疫传感器。采用一步法检测VP，免疫传感器在待测样品中室温孵育30 min。抗原一抗体免疫反应生成的免疫复合物部分屏蔽了免疫电极表面HRP的活性中心，从而减弱了HRP对硫堇和过氧化氢的催化能力。采用循环伏安法监测酶促反应，利用还原电流的减小来测定样品中的VP。在优化的免疫反应条件及电化学检测条件下，设定判定标准如下：△i<0.05μA为阴性；△i≥0.05μA为阳性。该免疫电极具有较好的特异性、重现性(RSD<6％)、稳定性(一周后电流响应为初始值的91％)和准确性(与ELISA符合率为97.5％)。因此，该免疫传感器可初步用于VP的快速筛检。 5.基于Nation/硫堇/纳米金的副溶血性弧菌无试剂电流型免疫传感器的研制 本实验采用静电吸附原理和自组装技术将Nafion、硫堇、纳米金和anti-VP修饰到玻碳电极表面形成敏感膜，从而制备副溶血性弧菌无试剂电流型免疫传感器。实验中采用电化学方法表征免疫传感器的制备过程。无需酶标抗体和复杂操作，根据抗原_抗体特异性结合形成的免疫复合物使得敏感膜有效扩散截面积减小，从而抑制硫堇氧化还原来实现对VP的检测。在优化的免疫反应条件及电化学检测条件下，设定判定标准如下：△i<0.5μA为阴性；△i≥0.5 μA为阳性。该免疫电极具有较好的特异性、重现性(RSD<10％)、稳定性(一周后电流响应为初始值的93％)和准确性(与ELISA符合率为97.5％)。因此，该免疫传感器可初步用于VP的快速筛检。 本论文以VP作为实验模型，对其进行了免疫学和电分析化学的研究，构建了定性检测VP的框架。该方法同时也可应用于其他抗原-抗体的研究。