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背景:膀胱癌（Bladder cancer,BC）是人类泌尿系统常见的一种癌症。世界卫生组织统计2020年膀胱癌新发病例57.3万例,死亡患者21.2万例,逐年增高的发病率和死亡率给家庭和社会带来巨大的负担。膀胱癌分为非肌层浸润性膀胱癌（低、中、高风险）和肌层浸润性膀胱癌,不同级别的膀胱癌治疗方式也各不相同,包括手术、化疗,卡介苗膀胱灌注以及放疗等。但膀胱癌的高复发率和肝、肺、骨转移是患者生存率降低的主要原因,目前治疗手段未能改变这一现状,传统治疗带来的毒副作用也是影响治疗效果的一个问题。因此,迫切的需要一种全新的高效、靶向的治疗药物来提高治疗效果并且降低毒副作用。基因治疗是指所有通过基因水平的干预来治疗疾病的一种方法,是一种很有前途的治疗策略,越来越受到人们的关注。膀胱肿瘤的研究中使用了大量的基因和非编码RNA,这些基因药物可能是未来治疗膀胱肿瘤的一种潜在的有效方法。目的:本文依据自杀基因HSV-TK、膀胱组织特异性启动子UPⅡ、腺相关病毒载体各自的优势,构建一个携带膀胱组织特异性启动子基因和自杀基因的重组腺相关病毒来改变病毒嗜性增加病毒的膀胱靶向性提高自杀基因的传导效率,提高rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP/GCV治疗策略的抗肿瘤作用。在体内体外评价重组病毒载体的治疗基因传递能力及治疗效果,为我们开发靶向高效的抗膀胱肿瘤基因治疗药物提供坚实的理论基础。方法:1、设计并构建重组腺相关病毒rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP,经PCR、基因测序对重组病毒载体进行检测,确定UPⅡ启动子基因序列和HSV-TK基因序列是否被成功插入重组病毒载体中;2、体外检测重组腺相关病毒载体的靶向性及安全性,重组病毒载体感染不同组织细胞株后,荧光显微镜下观察对比细胞绿色荧光表达程度,显微镜下观察并对比细胞生长状况,进一步证实重组病毒的安全性;3、重组腺相关病毒载体经膀胱内灌注给药后评估其穿透GAGS层感染膀胱上皮细胞的靶向性及安全性,重组病毒经导尿管膀胱内灌注,一周后处死小鼠,摘取膀胱、肝脏、肾脏、大脑,冰冻切片后在荧光显微镜下对比不同组织中绿色荧光表达情况,经HE染色评估重组病毒膀胱灌注给药后的安全性;4、蛋白水平检测重组腺相关病毒的靶向性和安全性,病毒载体感染细胞后提取蛋白经蛋白免疫印迹方法检测自杀基因蛋白的表达情况;5、实时无标记动态细胞分析技术动态对自杀基因治疗策略的效果和安全性进行检验,通过RTCA技术实时、动态评估自杀基因治疗策略的治疗效果,通过和对照组比较后评估治疗的安全性;6、重组腺相关病毒rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP/GCV治疗策略对小鼠皮下种植膀胱肿瘤的治疗效果评价,经过治疗后处死小鼠,摘取小鼠皮下种植的肿瘤组织,称重,通过HE染色、免疫荧光染色、TUNEL染色,探索基因疗法的治疗机制。结果:1、构建重组腺相关病毒rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP,经PCR、基因测序比对证实UPⅡ启动子和HSV-TK基因序列被插入载体中;2、重组病毒载体分别与MB49、UMUC3、LNCaP、293T、HuH7、SGC7901细胞培育24小时后,荧光显微镜下观察到膀胱肿瘤细胞表达的绿色荧光明显强于非膀胱肿瘤细胞,重组病毒载体和阴性对照病毒载体分别感染膀胱肿瘤细胞,重组病毒载体感染的膀胱肿瘤细胞绿色荧光表达明显强于阴性对照病毒;3、膀胱肿瘤细胞和非膀胱肿瘤细胞分别与重组腺相关病毒或PBS共培育24小时后,显微镜下对比两组细胞生长状况,发现两组细胞生长状态良好,重组病毒载体对细胞无毒副作用;4、小鼠被导尿后膀胱内灌注病毒载体,一周后处死小鼠并摘取膀胱、肾脏、肝脏、大脑组织冰冻切片,镜下观察到膀胱上皮细胞绿色荧光高表达,肝脏、肾脏、大脑无荧光表达,说明重组病毒载体对可以很好的穿透膀胱内侧GAGs层高效感染膀胱上皮细胞,在体内对膀胱上皮靶向性和安全性都非常优越;5、和野生型腺相关病毒对比,重组病毒改变了病毒的嗜性,增强其对膀胱上皮细胞的感染能力,同时证实人UPⅡ启动子同样可以增强病毒载体对鼠源性膀胱肿瘤的感染能力;6、重组rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP病毒载体和PBS经导尿管膀胱灌注给药后对膀胱、肝脏、肾脏组织HE染色后未发现出血、炎症等异常,说明病毒免疫原性低,对机体安全性高;7、在蛋白水平验证重组病毒的靶向性,发现膀胱肿瘤细胞内自杀基因高表达,而非膀胱肿瘤细胞内的表达非常微弱;8、CCK8和实时无标记动态细胞分析技术检测自杀基因治疗策略的效果和安全性,发现重组病毒载体、阴性对照病毒、前体药物对细胞生长均无影响,重组病毒和前体药物联合给药后15小时左右膀胱肿瘤细胞开始死亡、生长曲线下移,非膀胱肿瘤细胞的增殖不受影响;9、小鼠皮下成瘤,分组治疗后通过HE染色、BAX和caspase-3凋亡因子荧光标记、TUNEL染色后证实HSV-TK/GCV治疗策略通过细胞凋亡机制来发挥治疗作用。结论:1、UPⅡ启动子可以改变病毒载体的嗜性,增强病毒载体的靶向感染能力;2、rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP病毒载体在GAGs屏障层完整的情况下可以高效穿透并传导基因;3、人源性UPⅡ启动子对鼠源性膀胱上皮细胞有很好的组织相容性;4、rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP病毒携带的绿色荧光表达基因在细胞核内高表达,病毒穿透细胞膜、细胞核膜的能力强,在细胞核内表达治疗基因,便于更好的发挥治疗作用;5、rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP病毒载体拥有非常好的安全性;6、rAAV9-hUPⅡ-TK-EGFP病毒载体可以将胸苷激酶基因靶向导入膀胱肿瘤细胞,非膀胱肿瘤细胞未发现胸苷激酶基因的表达;7、HSV-TK/GCV治疗策略在体外研究证实具有强大的抗肿瘤作用;8、HSV-TK/GCV治疗策略对小鼠膀胱肿瘤模型的治疗效果明显;9、诱导发生的细胞凋亡是HSV-TK/GCV自杀基因疗法的机制之一。