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EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）是一种普遍存在的γ疱疹病毒,世界上约90%的人都曾感染EBV并获得适应性免疫。在特定的情况下,EBV感染可导致多种淋巴细胞和上皮细胞源性肿瘤的发生。EBV相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVa GC）是胃癌的一种独特的分子亚型,抑癌基因启动子区异常高甲基化的表观基因型状态在EBVa GC的发展过程中起关键作用,已有多项研究证明EBVa GC中宿主细胞DNA高甲基化现象较EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVn GC）更为普遍。DNA甲基化是目前为止研究最透彻的表观遗传机制,是在DNA序列不变的情况下调节基因转录的修饰形式,主要由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）家族催化完成。已知哺乳动物细胞中主要包括3种有活性的DNMTs:DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。目的:选择EBV阳性和阴性胃癌细胞为研究对象,探讨EBV对DNMT3a的调控作用,明确EBV核抗原1（Epstein-Barr nuclear antigen 1,EBNA1）和潜伏膜蛋白2A（Latent membrane protein 2A,LMP2A）通过影响DNMT3a表达参与EBVa GC发生发展的作用机制,为EBVa GC的治疗提供新的可选择的治疗靶点。方法:（1）采用GV657构建EBV核抗原EBNA1编码基因的表达载体（GV657-EBNA1）,转染EBV阴性胃癌细胞系BGC823和SGC7901,加入1mg/ml的嘌呤霉素（Puromycin）,筛选出稳定表达外源性EBNA1的细胞系BGC823-EBNA1和SGC7901-EBNA1。（2）实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）检测BGC823-EBNA1及SGC7901-EBNA1细胞中EBNA1 m RNA表达水平。（3）蛋白免疫印迹（Western Blot）检测BGC823-EBNA1、SGC7901-EBNA1以及瞬时表达EBNA1细胞中EBNA1、E2F转录因子1（E2F transcription factor 1,E2F1）及DNMT3a的蛋白表达水平。（4）免疫荧光（Immunofluorescence）技术检测DNMT3a在细胞中的定位。（5）分别采用靶向EBNA1、LMP2A、E2F1及DNMT3a编码基因的小干扰RNA作用EBV阳性胃癌细胞系SNU719,检测EBNA1、LMP2A、E2F1以及DNMT3a等相关基因的表达水平。（6）用NF-κB抑制剂BAY11-7082、靶向p65和IκBα编码基因的小干扰RNA处理EBV阳性胃癌细胞系SNU719,检测DNMT3a蛋白表达水平的变化。（7）CCK-8、Transwell、流式细胞术分析DNMT3a对EBV阳性和阴性胃癌细胞增殖、周期、凋亡以及迁移的作用。（8）用DNMT抑制剂5-Aza-Cd R处理EBV阳性胃癌细胞系SNU719,检测BZLF1蛋白表达水平及基因组DNA整体甲基化水平变化。结果:（1）重组表达载体GV657-EBNA1转染并筛选3周后,镜下观察到90%以上的绿色荧光蛋白,结果显示BGC823和SGC7901细胞系可稳定表达外源性EBNA1。（2）BGC823-EBNA1和SGC7901-EBNA1细胞中可检测到EBNA1 m RNA转录,而对照细胞无EBNA1 m RNA转录。（3）BGC823-EBNA1和SGC7901-EBNA1细胞中可检测到EBNA1蛋白表达;与对照组比较,E2F1和DNMT3a的表达在稳定和瞬时转染EBNA1的细胞中明显上调。（4）免疫荧光检测结果显示,DNMT3a的荧光强度在瞬时转染EBNA1的EBV阴性胃癌细胞系中明显增强,且在细胞核和细胞质中均有表达。（5）在EBV阳性胃癌细胞系SNU719中干扰EBNA1表达后,E2F1和DNMT3a表达均下调;分别干扰LMP2A和E2F1后,DNMT3a表达也均下调。（6）分别采用BAY11-7082和靶向p65编码基因的小干扰RNA抑制NF-κB信号通路后,DNMT3a的表达受到抑制;而靶向干扰IκBα表达,激活NF-κB信号通路后,DNMT3a的表达则明显增加。（7）在EBV阳性胃癌细胞系SNU719和EBV阴性胃癌细胞系SGC7901中抑制DNMT3a表达后,与对照组比较,CCK-8结果显示细胞增殖受到抑制,流式细胞分析检测显示细胞周期被阻滞在G1/S期、细胞凋亡程度明显增加,Transwell结果显示细胞迁移能力明显下降。（8）用5-Aza-Cd R处理EBV阳性胃癌细胞系SNU719后,BZLF1蛋白表达水平明显升高,且基因组DNA甲基化程度增加。结论:（1）EBV可以通过EBNA1和LMP2A促进EBV阳性胃癌细胞DNMT3a的表达。（2）EBNA1通过激活转录因子E2F1诱导DNMT3a表达上调;LMP2A通过激活NF-κB信号通路上调DNMT3a表达。（3）DNMT3a可促进EBV阳性胃癌和EBV阴性胃癌细胞的增殖、G1-S期进程、迁移以及抑制细胞凋亡。（4）DNMT3a有助于维持EBV阳性胃癌细胞中EBV潜伏状态以及促进基因组DNA甲基化水平。