肾癌是起源于肾小管上皮细胞的恶性肿瘤,占肾脏恶性肿瘤的80%～90%,成人恶性肿瘤的2%～3%。随着生活水平的提高和医学影像学的进步,在早期诊断和早期手术方面均取得满意效果。但对于术后复发和伴有转移灶的晚期肾癌患者目前尚缺乏较好的治疗方案,临床上通常以临床分期和病理分级作为判断预后的依据,有一定的局限性。因此,寻找预测肾癌恶性程度的生物学标记物,已成为肾癌研究的热点,以便为肾癌的生物治疗提供新靶点和新思路。促红细胞生成素产生肝细胞受体(erythropoietin producinghepatoma receptor,Eph)家族是一类新发现的酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinases,RTKs)。EphA2是其中最早被发现的一个成员,在正常上皮细胞中表达,广泛高表达于不同的肿瘤组织(乳腺癌、结肠癌、食管癌、前列腺癌、恶性间皮癌等)和细胞系。EphA2在正常上皮细胞中位于细胞连接处,配体EphrinA1能以较高的亲和力与EphA2结合,两者结合后能导致受体和配体均发生酪氨酸磷酸化而产生双向信号传导,通过其下游信号调节细胞正常的生长、发育,同时也促进EphA2受体自身的降解。在恶性肿瘤细胞中EphA2定位异常,由细胞连接处转变为广泛分布于细胞表面,导致EphA2难以有效的与其配体接触,因而其自身的降解减少,所以在许多侵袭性肿瘤中EphA2和EphrinA1通常是过表达的。有学者通过一种模拟配体EphrinA1-Fc干预肿瘤细胞株(PC-3、293、Cos-7),显示EphA2受体活化、磷酸化程度增强,细胞形态学发生变化。因此,EphA2在肿瘤研究中被学者广泛关注。有报道,肾癌组织中EphA2高表达可能与肾癌术后无瘤生存期有关,但关于EphA2及配体EphrinA1相互作用的生物学变化及配受体在肾癌中表达和机制研究国内外报道较少。一般认为肿瘤组织类型及恶性程度与疾病的转归和预后有关,在肾癌的不同病理类型中以肾透明细胞癌所占比例较高,为此,本课题通过对EphA2及其配体EphrinA1在肾透明细胞癌组织中的表达及与肾癌临床病理特征、E-cadherin和微血管密度(microvessel density,MVD)关系的研究,探讨EphA2及其配体EphrinA1在肾癌转移中的作用;并通过人工配体EphrinA1-Fc对人肾透明细胞癌786-O细胞系和裸鼠人肾癌细胞移植瘤干预和治疗研究,探讨EphA2与配体EphrinA1结合的生物学效应及其抗肿瘤的分子机制,为EphA2/EphrinA1在肾癌中表达及其在肾癌转移中的作用机制研究提供实验依据。第一部分EphA2/EphrinA1在肾癌中的表达及生物学意义目的:通过检测EphA2、EphrinA1在正常肾组织和肾透明细胞癌组织中蛋白和基因表达情况,探讨其在肾癌高表达的机制。方法:采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术检测22例肾癌组织和12例非肾癌正常肾组织中EphA2和EphrinA1的基因及蛋白表达情况,并对其进行比较和相关分析。结果:1 RT-PCR显示:肾癌组织与正常肾组织中均有EphA2和EphrinA1的基因表达,但肾癌组织中EphA2和EphrinA1的mRNA的相对表达量明显高于正常肾组织(1.60±0.80 vs 0.58±0.19,P＜0.01;1.37±0.63vs 0.91±0.40,P＜0.01)。2流式定量显示:肾癌组织中EphA2和EphrinA1蛋白的表达量明显高于正常肾组织(424.38±43.14 vs 332.44±42.83,P＜0.01;419.44±52.13 vs 325.36±42.33,P＜0.01)。3相关分析显示,肾癌组织中EphA2、EphrinA1蛋白表达量与其mRNA表达量均无明显相关(r=0.05,P=0.826;r=-0.171,P=0.448)。小结:EphA2和EphrinA1蛋白高表达于肾癌组织,其机制除与基因表达上调有关外,蛋白质生物学异常也可能是导致其升高的重要因素,提示EphA2和EphrinA1蛋白高表达在肿瘤发病中可能具有重要意义。第二部分EphA2/EphrinA1在肾癌转移中的作用目的:通过对EphA2及其配体EphrinA1在肾癌组织中的表达与肾癌患者临床病理特征、E-cadherin和MVD的关系研究,探讨EphA2及其配体EphrinA1在肾癌转移中的作用。方法:利用免疫组织化学法检测68例肾透明癌组织、24例正常肾组织中EphA2、EphrinA1和E-cadherin的表达;并采用CD34抗体标记微血管内皮细胞,计算微血管密度(microvessel density,MVD)。分析EphA2、EphrinA1蛋白的表达与肾癌临床病理特征、E-cadherin、MVD之间的关系。结果:1 EphA2、EphrinA1在肾癌组织中的表达及其与肾癌临床病理特征的关系免疫组化结果显示:EphA2、EphrinA1蛋白阳性表达在胞浆和胞膜。EphA2和EphrinA1蛋白的表达在肿瘤组织分级不同的各组间有显著性的差异(x~2=12.611,P=0.002;x~2=8.473,P=0.014),随着等级的增加其蛋白表达量也显著增加(r=0.431,P=0.000;r=0.355,P=0.003;);EphA2和EphrinA1蛋白的表达在高分期(Ⅲ、Ⅳ期)组显著高于低分期(Ⅰ、Ⅱ期)组(Z=-2.975,P=0.003;Z=-2.006,P=0.045),淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组的(Z=-2.320,P=0.02;Z=-2.792,P=0.005),肿瘤直径＞7cm与≤7cm两组间、年龄≥45岁与＜45岁两组间、男女性别两组间其蛋白的表达均无显著性差异(P值均＞0.05)。2 E-cadherin在肾癌组织中的表达及其与肾癌临床病理学特征的关系免疫组化结果显示:E-cadherin蛋白阳性表达在胞膜,呈棕黄色颗粒。在肾癌组织中,E-cadherin蛋白的表达明显低于正常肾组织(Z=-6.101,P＜0.0001)。E-cadherin蛋白的表达在肿瘤组织分级不同的各组间有显著性的差异(x~2=8.493,P=0.014),随着等级的增加,其表达量显著降低(r=-0.320,P=0.008);E-cadherin蛋白的表达在高分期组、淋巴结转移组显著低于低分期组、无淋巴结转移组(Z=-2.037,P=0.042;Z=-2.217,P=0.027);肿瘤直径＞7cm与≤7cm两组间、年龄≥45岁与＜45岁两组间、男女性别两组间蛋白的表达均无显著性差异(P值均＞0.05)。3 MVD在肾癌组织中的表达及其与肾癌临床病理学特征的关系免疫组化结果显示:CD34主要表达于血管内皮细胞膜。微血管染色呈棕黄色,最密集染色区域即“热点”主要位于癌灶边缘。肾癌组织中MVD显著高于正常肾组织(P＜0.01)。在肿瘤组织分级不同的各组间,MVD有显著性差异(x~2=23.637,P＜0.01),并且随着分级等级的增加MVD也显著增加(r=0.592,P＜0.0001);MVD在肾癌组织的高分期组、淋巴结转移组、肿瘤直径＞7cm组显著高于低分期组、无淋巴结转移组、肿瘤直径≤7cm组(Z=3.735,P＜0.0001;Z=-3.4,P=0.001;Z=-3.522,P＜0.0001)。年龄≥45岁与＜45岁两组间、男女性别不同的两组间MVD均无显著性差异(P值均＞0.05)。4 EphA2、EphrinA1和E-cadherin蛋白、MVD的相关性相关分析显示,68例肾癌组织中EphA2和EphrinA1蛋白表达呈显著正相关(r=0.772,P＜0.0001);E-cadherin蛋白的表达与EphA2、EphrinA1蛋白的表达均呈显著负相关(r=-0.378,r=-0.414,P值均＜0.01);EphA2和EphrinA1蛋白的表达与MVD呈显著正相关(r=0.555,r=0.485,P值均＜0.01)。小结:EphA2和EphrinA1蛋白高表达于肿瘤高分期组、高分级组和淋巴结转移组,与E-cadherin蛋白表达呈显著负相关,与MVD呈显著正相关,提示EphA2和EphrinA1蛋白的高表达预示肿瘤恶性程度的增加,其机制可能通过影响或协同E-cadherin和微血管生成来实现的。第三部分EphrinA1-Fc对人肾透明癌786-O细胞系抗肿瘤效应机制的研究目的:通过人工可溶性配体EphrinA1-Fc干预人肾透明细胞癌786-O细胞系抗肿瘤效应及其分子机制的实验研究,探讨EphA2在肿瘤细胞增殖、转移中的作用及机制。方法:应用可溶性配体EphrinA1-Fc对人肾透明细胞癌786-O细胞系进行体外干预实验,观察不同时间点细胞形态学的变化,对不同时间点细胞内EphA2和ERK1/2的磷酸化程度进行分析,并观察可溶性配体反复刺激786-O后的细胞增殖情况。结果:1 EphrinA1-Fc干预后细胞形态学变化正常条件下培养的肾癌细胞接受可溶性配体EphrinA1-Fc刺激1min,细胞形态即发生改变,细胞由梭形伸展状态开始回缩;5min时部分细胞变圆;30min时90%细胞变圆、与瓶壁结合疏松;40min时部分细胞重新伸展、粘附于瓶壁;60min时90%细胞恢复到刺激前状态。对照组细胞形态学未发生明显变化。2 EphrinA1-Fc干预对磷酸化EphA2(p-EphA2)的影响Western blotting结果显示:EphrinA1-Fc干预5min、10min、30min、60min后p-EphA2的相对表达量(p-EphA2/EphA2)分别是0.15±0.04、0.19±0.01、0.21±0.03和0.10±0.00。p-EphA2的相对表达量各组间有显著性差异(F=9.392,P=0.025)。组间两两比较,除5min与60min组、10min与30min组间无显著性差异,余各组间比较均有显著性差异(P值均＜0.05)。EphrinA1-Fc干预前及对照组不同时间点均未见其表达。3 EphrinA1-Fc干预对磷酸化ERK1/2(p-ERK)的影响Western blotting结果显示:EphrinA1-Fc干预5min、10min、30min、60min后p-ERK的相对表达量(p-ERN/ERK1/2)分别是0.15±0.07、0.22±0.06、0.26±0.03和0.13±0.04。p-EphA2的相对表达量各组间有显著性差异(F=4.428,P=0.041)。组间两两比较,5min与30min组、60min与30min组间比较均有显著性差异(P值均＜0.05),余各组间无显著差异(P值均＞0.05)。EphrinA1-Fc干预前及对照组不同时间点均未见其表达。4 EphrinA1-Fc干预对细胞增殖的影响EphrinA1-Fc干预人肾透明细胞癌786-O细胞株12天,两组细胞形态均未发生改变,但细胞的增殖状况发生了变化。EphrinA1-Fc组细胞数明显低于对照组((1.96±0.29)×10~5vs(3.14±0.49)×10~5,P＜0.01)。小结:EphrinA1-Fc能抑制786-O细胞株的增殖、降低细胞黏附,其机制可能是通过影响胞内EphA2、ERK磷酸化实现的。第四部分EphrinA1-Fc对裸鼠人肾癌细胞移植瘤的影响目的:探讨EphrinA1-Fc对裸鼠人肾癌细胞移植瘤的影响及其作用机制。方法:将表达EphA2抗原阳性的人肾透明细胞癌786-O细胞株体外培养后接种于裸鼠皮下,建立动物移植瘤模型,观察实验组(瘤周注射EphrinA1-Fc)和对照组(瘤周注射IgG-Fc)移植瘤的生长情况,并采用免疫组化法检测EphA2、E-cadherin及MVD的表达情况。结果:1裸鼠人肾癌细胞移植瘤模型的建立14只裸鼠接种786-O细胞株7周,共8只裸鼠在注射部位发现米粒大小结节,表明人肾癌细胞移植瘤模型建立成功,接种成功率为60%。2 EphrinA1-Fc对裸鼠人肾癌细胞移植瘤生长影响接种786-O细胞株8周,移植瘤平均体积为(382.35±122.04)mm~3;干预治疗4周,裸鼠一般状态良好,未见明显的异常反应。重复测量设计方差分析显示,时间和药物干预因素对移植瘤体积均有影响(F=4.085,P=0.012;F=7.469,P=0.034)。独立样本的非参数检验显示,治疗组干预治疗2周,移植瘤体积较对照组无明显差异[(272.65±55.35)mm~3 vs(535.97±216.07)mm~3,P=0.191)],干预治疗4周,移植瘤体积较对照组明显减小[(115.10±49.16)mm~3 vs(800.00±269.69)mm~3,P=0.021)]。肿瘤抑瘤率为80.62%。3 EphrinA1-Fc对裸鼠人肾癌细胞移植瘤中EphA2、E-cadherin和MVD的影响干预治疗4周,治疗组瘤内的EphA2蛋白的表达低于对照组;E-cadherin蛋白的表达高于对照组;治疗组MVD较对照组减少。小结:表达EphA2阳性的肾透明细胞癌786-O具有致瘤性,但成瘤率低且成瘤时间长;瘤周注射EphrinA1-Fc可抑制肿瘤细胞的生长,其机制可能通过增加E-cadherin蛋白表达和抑制肿瘤血管生成实现的,反证了EphA2和EphrinA1的高表达可能通过促进细胞增殖、降低细胞与细胞黏附、促进血管生成促进人类肾癌的发生。结论:1、EphA2/EphrinA1基因和蛋白高表达于肾癌组织。其蛋白高表达的机制可能是自身降解下降、基因表达上调共同参与的结果。2、EphA2/EphrinA1基因和蛋白高表达促进了肾癌细胞增殖、肿瘤新生血管生成,增强了肿瘤细胞与ECM黏附,削弱了细胞间连接,从而促进人类肾癌的发生和转移。3、人工可溶性配体EphrinA1-Fc能抑制肾癌细胞的生长,为生物靶向治疗提供了动物实验依据。4、EphA2和EphrinA1蛋白的高表达预示肾癌细胞侵袭能力强。联合检测EphA2、EphrinA1和E-cadherin三种蛋白的表达对于评价肾癌的恶性程度、判断其转移的危险性,可能具有一定的参考价值。