水稻黄单胞菌的两个致病变种水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola, Xooc)是模式植物水稻(Oryza sativa)上的两种模式病原菌,分别引起水稻白叶枯病(bacterial blight, BB)和水稻细菌性条斑病(bacterial leaf streak, BLS),影响了亚洲大部分、非洲部分地区主要粮食作物的生产。水稻白叶枯菌(Xoo)从被发现至今100多年的历史中,一直是植物病理学研究者关注的焦点。研究水稻抗病基因(R)和Xoo无毒基因(A)的互作是阐明抗病基因和Xoo的致病性分化、鉴定小种、无毒基因、致病基因等的基本依据,也是发展有效的病害防治措施的需要。Xoo的小种分化涉及到对现有抗病品种的潜在利用价值。各国的Xoo代表菌株在科研和生产实践中都具有十分重要的意义。在寄主植物上的过敏反应HR最初被认为是一种“抗病现象”受到广泛关注,而病原细菌在非寄主烟草上的HR症状也是判定一个细菌分离物是否具有植物致病性的重要指标。由于HR现象与植物病原菌的致病性及寄主和非寄主植物的抗病性或内生免疫有着重要的关系,因此,研究Xoo菌株在寄主水稻上产生HR相关的avrBs3/pthA家族无毒基因和使非寄主烟草丧失产生HR的文库克隆pA254的组成和功能为更好地阐释植物细菌致病机理,植物病害抗病机理和植物与微生物学的其他方面的基本原理,同时也为内生免疫等方面带来重要启示。1 Xoo代表菌株致病多样性分析通过苗期注射接种法和成株期剪叶接种法,研究了20个来自中国、日本和菲律宾的Xoo不同致病型的代表菌株与36个水稻品种的互作关系。Xoo注射接种入14d的36个水稻品种的叶片中进行非亲和互作的HR表型测定,并对接种后第2-5d的接种叶片进行DAB溶液染色,检测接种叶片中活性氧爆发的情况,来观察HR发生情况。结果显示OS-198与所测试36个水稻品种苗期叶片中都发生有不同程度的非亲和互作,PX061、JXOI、OS-189菌株等与所测试36个品种中大多数品种之间存在特异性互作关系。Xoo注射接种所产生的症状是一复杂的表型,JXOI与IRBB1、IRBB2等发生特异性的互作,产生肉眼可见的典型的HR症状,表现出质量性状,但是更普遍现象是多数的Xoo在水稻品种上产生一种混合症状,即water-soaking症状和HR反应同时存在,但是病斑长度没有明显的变化,推测Xoo中所含有多数的avrBs3/pthA基因具有的无毒性属于一种数量累加效应,不是质量性状。研究结果明确了白叶枯菌与水稻近等基因系等36个水稻品种的互作关系,报道了在Xoo-水稻互作系统中的非亲和性互作与氧爆发的关系,推测不同代表菌株中可能含有的无毒基因,这为克隆对应R基因的无毒基因以及揭示水稻黄单胞菌致病性变异机制奠定了工作基础和提供了科学线索和依据。成株期剪叶接种结果显示在36个水稻品种中,基因累加品系IRBB54(xa5+Xa21)和IRBB55(xa13+Xa21)抗所有测试菌株,在20个测试菌株中,没有发现对36个水稻品种都致病的菌株。带有显性抗病基因Xa4、Xa7、Xal7、Xa21和隐性抗病基因xa5、xa13、xa24的水稻品种对50%以上的测试代表菌株抗病,而带显性抗病基因Xa1、Xa2、Xa10、Xa11、Xa12、Xa14、Xa18和隐性抗病基因xa8、xa19、xa20的水稻品种对50%以上的测试的代表菌株感病,籼稻IRBB3(Xa3)感病的品种也超过50%。IRBB21(Xa21)拥有最广的单基因抗性谱。IRBB54和IRBB55是抗病表现最好的双抗病基因组合的品种。常规品种TN-1感所有的测试菌株,IR26、BJ1、Asminori、Wase Aikoku 3和DV85对60%以上的测试菌有抗性.IR24、Java14、Tetep和Cas209对60%以上的测试菌感病。Xoo在36个水稻品种上的致病表型把测试菌株分成19个致病型,每个代表菌株的致病性各不相同。根据致病型的相似性,19个致病型可聚成7个类群(Cluster),聚类群3是优势群,分布最广,包含有测试的3国的代表菌株。2 Xoo代表菌株的小种遗传多样性分析有证据表明水稻黄单胞菌都含有15个以上的avrBs3/pthA家族基因,它们具有几乎一样的5’端和3’端,不同的只是中间102 bp重复单元的重复数不同。本研究参照PXO99A全基因组序列中已知的avrBs3/pthA基因的组成、数目和序列,以avrBs3/pthA家族成员avrXa3的中间保守区域大小为2.4kb-BamHI和1.4kb-SphI的中间片段为探针,对20个Xoo的代表菌株和Xooc菌株RS105的分别用BamHI和SphI酶切的基因组DNA进行Southern杂交作RFLP分析。杂交结果显示Xoo中很高的avrBs3/pthA家族成员遗传组成多样性。发现Xoo的不同小种间所含有的avrBs3/pthA基因的拷贝数不同,有些条带在所有的小种中都存在,有些条带是某个小种所特有的。发现探针的同源片段主要集中在1000bp到5000bp这个区间,意味着102bp的重复数大约有9-50个,每个菌株有12-38个同源拷贝。各国水稻白叶枯菌间至少共有4.3kb、4.0kb、3.9kb、3.8kb、3.5kb、3.1kb、2.8kb大小的BamHI片段或3.2kb、2.9kb、2.8kb、2.5kb、2.3kb、2.1kb、1.8kb大小的SphI片段的7个大小相同或相近的avrBs3/pthA家族基因。这些共有的基因在维护和展现水稻白叶枯菌的共性特征方面发挥着重要的作用。20个参试菌中总共鉴定了19种RFLP分子型(haplotype),根据分子型的相似性分为7个系群(Lineage).3.Xoo菌株PXO99A的无毒基因缺失突变分析水稻白叶枯菌中含有数目不等的无毒基因,但对大多数无毒基因的功能所知甚少。通过对同源重组获得的一个PXO99A无毒基因的突变体PXO99Δavr,进行Southern杂交验证、突变序列分析和水稻成株期剪叶接种的致病性测定。结果证实了突变体缺失了5个无毒基因,同源重组发生在PXO99A全基因组中一个有5个无毒基因串连的位点上。水稻成株期致病性测定结果表明突变体PXO99Δavr在IRBB10等15个水稻品种上的病斑长度比PXO99A明显缩短,在IRBB14、IRBB21和IRBB55上病斑变长,缺失的5个无毒基因的的综合表现为毒性因子功能。推断在缺失的基因中含有无毒基因avrXa14、avrXa21、avrxal3以及和抗病基因Xa3、Xa4、xa5、Xa10、Xal7亲和互作有关的毒性因子。为利用自杀式载体pKNG101建立模式菌株PXO99A的无毒基因缺失突变体库,进一步研究PXO99A中各无毒基因的功能做了一些初步的探索。4.无毒基因avrXa3介导的水稻白叶枯病菌在不同水稻品种上的致病适应性分析从水稻白叶枯JXOIII菌株中克隆到一个无毒基因avrXa3,它属于avrBs3/pthA家族成员。根据无毒基因avrXa3的序列,构建了水稻白叶枯PXO99A菌株缺失5个串联的无毒基因的突变体PXO99Δavr。将avrXa3导入PXO99A和PXO99Δavr后,得到衍生菌株PXO99A/avrXa3, PXO99Δavr/avrXa3,与36个含不同抗病基因的水稻品种进行互作分析。结果显示导入avrXa3后的菌株在不同的水稻品种上表现出了明显的寄生适应性变化。进一步分析证明无毒基因avrXa3在Wase Aikoku 3、IRBB2、IRBB3、IRBB203、IRBB204、IRBB205、IRBB211、IRBB53、IR24、TN-1等11个水稻上病斑缩短,表现明显的无毒活性；在IRBB21、IRBB10、IRBB14、IR26、Cas209、Java14等6个品种病斑明显变长,体现无毒基因的毒性功能。实验结果表明,无毒基因avrXa 3对PXO99A中其它无毒基因的表达有明显干扰作用,单个效应分子的变化也会使细菌在不同水稻品种上的寄生适应性发生复杂的改变。5.Xoo菌株与非寄主HR相关的PXO99A基因文库克隆pA254的功能分析来源于水稻白叶枯病菌PXO99A的文库克隆pA254,分别使水稻黄单胞菌PXO99A和RS105的致病力下降及丧失在烟草上激发过敏反应的能力。用SacI、EcoRI、KpnI和BamHI四种内切酶进行了交叉消化,构建了文库克隆pA254的酶切物理图谱。亚克隆导入RS105进行功能互补,在烟草上进行HR测定。结果显示亚克隆获得SacI, KpnI, EcoRl, BamHI完全和不完全酶切的29个亚克隆,导入RS105得到的接合子,都可以使烟草产生HR反应,没有与文库克隆pA254表型一致的亚克隆,即还未获得pA254的最小的功能片段。对所获得的pA254的亚克隆进行测序分析,通过序列同源性分析发现pA254与已经公布的PX099A的全基因组序列100%同源,与另外2个水稻白叶枯病菌具有99%以上同源性。这个克隆带有的外源片段大小为42572bp,位于PX099A基因组序列中相对保守的区域,包含约46个基因,也分别和MAFF11081和KACC10331中的37和42个基因同源。其中发现有毒力调控子基因、毒力蛋白基因、转录抑制子和含HTH基序的转录调控子等毒力相关因子,另外还有12个为未知功能基因,推测为保守的蛋白,4个转座酶基因,4个DNA连接酶,3个细胞色素C氧化还原酶,2个谷胱甘肽S转移酶,2个氨基酸-tRNA(Asp)合成酶,2个饥饿胁迫蛋白,2个抑制子(多羟基链烷酸合成抑制子),有一个乙酰辅酶Co-A还原酶,GumN蛋白和脂蛋白,YjeF家族蛋白,DNA错配修复酶,铁硫簇结合蛋白,乙酰丙氨酸酰胺酶,脱氧核糖核酸酶(亦称DNase),核糖核酸酶,可溶解胞壁转糖基酶等。文库克隆中有一大小约21kb的序列具有基因岛或致病岛的许多典型特征：带有1个或多个毒力相关因子、它们有明显的GC含量的变化,在连接处有整合酶基因,边界有tRNA作为整合位点,还有多个遗传移动性基因转座酶基因以及氨基酸偏爱密码子等。推测文库克隆pA254是hrp致病岛以外另一个和非寄主HR有关新的致病岛或基因岛(genomic island)。