背景结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,其发病率居所有恶性肿瘤第三位,死亡率居所有恶性肿瘤第二位。人参皂苷Rg3是由人参中提取的活性成分,其可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进肿瘤细胞凋亡。WEE1蛋白是调控细胞周期G2检查点的重要基因,其表达变化可影响DNA损伤药物顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶等药物对细胞的杀伤作用。在胃癌和卵巢癌的研究中发现,人参皂苷可协同增敏顺铂和5-氟尿嘧啶对细胞的增殖抑制效应。然而,人参皂苷Rg3、DNA损伤药物和WEE1蛋白之间的作用并未见相关报道,本研究主要探讨三者之间的相互关系,探讨人参皂苷Rg3增敏DNA损伤药物的相关分子机制。第一部分人参皂苷Rg3通过抑制WEE1激酶表达增敏结肠癌对DNA损伤药物敏感性的机制研究研究目的探讨人参皂苷Rg3是否可影响结肠癌细胞对DNA损伤药物顺铂和5-氟尿嘧啶的增殖抑制效应及其机制。研究方法1.为了探讨人参皂苷Rg3联合DNA损伤药物顺铂或5-氟尿嘧啶对Wi Dr、SW948和COLO205等结肠癌细胞增殖活性的影响。应用CCK-8细胞增殖活性检测法,检测不同浓度人参皂苷Rg3联合不同浓度DNA损伤药物顺铂或5-氟尿嘧啶干预Wi Dr、SW948和COLO205三株结肠癌细胞后对其细胞增殖活性的影响。2.为了探讨人参皂苷Rg3影响结肠癌细胞增殖活性的潜在机制。应用q RT-PCR法检测不同浓度人参皂苷Rg3干预相同时间和相同浓度人参皂苷Rg3干预不同时间后结肠癌细胞内WEE1的表达水平变化。3.为了探讨WEE1过表达在人参皂苷Rg3影响结肠癌细胞对DNA损伤药物顺铂和5-氟尿嘧啶敏感性过程中的作用。首先应用质粒过表达技术对Wi Dr,SW948和COLO205等结肠癌细胞进行WEE1过表达,并应用q RT-PCR法检测过表达程度;其次应用CCK-8细胞增殖活性检测法检测10μM/L顺铂+75μM/L人参皂苷Rg3+不同pc DNA-WEE1浓度和3μM/L 5-氟尿嘧啶+50μM/L人参皂苷Rg3+不同pc DNA-WEE1浓度等处理对于结肠癌细胞增殖活力的影响。结果1.顺铂和5-氟尿嘧啶对于结肠癌细胞Wi Dr、SW948和COLO205等增殖活力的抑制成浓度依赖性增加;随着应用人参皂苷Rg3浓度(0μM/L、25μM/L、50μM/L、75μM/L)的增加,在应用相同浓度顺铂或5-氟尿嘧啶的前提下,Wi Dr,SW948和COLO205等结肠癌细胞的增殖活力逐渐降低;2.应用人参皂苷Rg3干预三株结肠癌细胞,随着人参皂苷Rg3干预浓度(0μM/L、25μM/L、50μM/L、75μM/L和100μM/L)的增加,Wi Dr、SW948和COLO205等结肠癌细胞中WEE1的表达明显降低;应用50μM/L人参皂苷Rg3干预三株结肠癌细胞,随着人参皂苷Rg3干预时间(0 h、6 h、12 h、18 h和24h)的增加,Wi Dr,SW948和COLO205等结肠癌细胞中WEE1的表达逐渐降低;3.应用pc DNA-WEE1质粒可在三株结肠癌细胞中成功上调WEE1的表达;在相同浓度顺铂(10μM/L)+人参皂苷Rg3(75μM/L)干预的前提下,随着pc DNA-WEE1质粒转染浓度(10 ng、50 ng、100 ng、150 ng)的增加,Wi Dr、SW948和COLO205等结肠癌细胞的增殖活力逐渐增加;在相同浓度5-氟尿嘧啶(3μM/L)+人参皂苷Rg3(50μM/L)干预的前提下,随着pc DNA-WEE1质粒转染浓度(10ng、50 ng、100 ng、150 ng)的增加,Wi Dr、SW948和COLO205等结肠癌细胞的增殖活力逐渐增加。结论1.人参皂苷Rg3可增敏DNA损伤药物(顺铂和5-氟尿嘧啶)对结肠癌细胞增殖活力的抑制效应;2.人参皂苷Rg3对WEE1表达的抑制效应呈浓度依赖性和时间依赖性增加;3.过表达WEE1可减弱人参皂苷Rg3增敏DNA损伤药物(顺铂和5-氟尿嘧啶)对结肠癌细胞增殖活力的抑制效应。第二部分WEE1在结直肠癌组织中的表达及临床病理意义分析研究目的探讨WEE1蛋白在结直肠癌中的表达与结直肠癌患者临床病理参数和预后的相关性。研究方法1.为了探讨WEE1在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达,应用Western blot和q RT-PCR法检测新鲜结直肠癌组织和癌旁组织中WEE1的表达;2.为了明确WEE1蛋白在结直肠癌组织中的表达与结直肠癌患者临床病理资料的相关性。应用卡方检验分析WEE1蛋白的阴性表达和阳性表达与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径、肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、有无远处转移、血清CEA水平、有无腹膜转移、T分期、N分期、M分期及TNM分期等临床病理参数的相关性;3.为了探讨WEE1蛋白在结直肠癌组织中的表达与结直肠癌患者预后的相关性,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,以Log-rank检验比较WEE1蛋白的阴性表达和阳性表达与患者预后的相关性;应用单因素和多因素Cox回归分析影响结直肠癌患者预后的危险因素。研究结果1.在33例结直肠癌患者病理标本中,18例患者的结直肠癌组织中,WEE1蛋白和m RNA呈高表达;而15例患者的结直肠癌组织中,WEE1蛋白和m RNA呈低表达;2.免疫组织化学结果示,在142例患者的石蜡包埋结直肠癌组织中,WEE1蛋白在86例中呈阳性表达,在56例中呈阴性表达;3.WEE1阳性表达与结直肠癌患者的肿瘤分化程度(P=0.033)、N分期(P=0.005)、TNM分期(P=0.009)、Duke’s分期(P=0.001)和淋巴结转移(P=0.006)等参数有明显相关性,结果具有统计学意义;4.根据WEE1蛋白表达水平,将所有结直肠癌患者分为阳性表达组和阴性表达组,WEE1阳性表达组患者的平均生存时间明显短于WEE1阴性表达组;单因素分析结果示,肿瘤大小(HR=0.5,95%置信区间0.263-0.949,P=0.034)、TNM分期(HR=1.402,95%置信区间0.934-6.176,P=0.012)、M分期(HR=1.562,95%置信区间0.231-4.685,P=0.002)、肝转移(HR=3.462,95%置信区间1.265-10.256,P=0.014)和WEE1表达(HR=7.608,95%置信区间3.019-19.185,P<0.001)是影响结直肠癌患者预后的危险因素;多因素Cox比例风险回归模型结果示,TNM分期(HR=2.899,95%置信区间2.072-8.056,P<0.001)和WEE1表达(HR=6.533,95%置信区间2.93-14.566,P<0.001)是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素。5.在I期结直肠癌患者中,WEE1的表达与患者OS和DFS并无明显相关性,而在II期和III期结直肠癌患者患者中,WEE1阳性表达提示患者OS和DFS较差。研究结论WEE1在结直肠癌组织中呈高表达;其阳性表达提示结直肠癌患者预后较差;WEE1阳性表达和TNM分期是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素。