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糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病的严重并发症,高血糖、血脂代谢异常、微血管循环障碍和炎症反应等都可以引起DN的发生。DN的主要病理表现是肾小管纤维化、肾小球基底膜增厚、系膜细胞异常增殖、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）增生和足细胞损伤等。足细胞损伤是DN的显著性标志,研究发现,足细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）和凋亡在DN足细胞损伤中起着重要作用,足细胞发生EMT和凋亡会使足细胞的数量急剧减少,足细胞的功能显著降低,导致肾小球的滤过屏障受损,肾小球的滤过功能变化,出现蛋白尿,加重DN。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是一类长度超过200个碱基对且不具有编码蛋白质功能的RNA,可通过多种途径增强或抑制靶点基因表达,影响细胞生长、侵袭、迁移和凋亡。表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）是一种低分子多肽,活化的EGF能够刺激细胞增殖、迁移和EMT等过程。叉头转录因子1（forkhead box O 1,FOXO1）是调控细胞功能的重要转录因子,主要通过影响下游多种转录靶点的表达来调控细胞代谢、氧化应激、凋亡和炎症反应等过程。小檗碱（berberine,BBR）是一种季铵类生物碱,具有降血糖、调节血脂、抑制炎症、抗氧化和肾脏保护等作用,能够治疗DN、高血压等多种疾病。课题组前期研究发现lncRNALOC102549726在DN肾脏组织和足细胞中异常上调,其可能通过上调EGF的表达引起足细胞损伤。但lncRNALOC102549726如何通过EGF引起足细胞损伤以及BBR对其的作用仍不清楚,其具体机制还需继续探索。本研究拟通过体内外实验阐明lncRNA LOC102549726/EGF信号通路引起足细胞损伤的具体作用机制和BBR对其的调节作用,探讨lncRNALOC102549726是否通过靶向EGF影响FOXO1信号通路的表达从而影响DN足细胞EMT和凋亡,引起足细胞损伤,以及BBR是否通过调控lncRNA LOC102549726及其相关信号通路的表达来缓解DN足细胞EMT和凋亡,减轻足细胞损伤。目的:1.明确lncRNA LOC102549726及其相关信号通路对DN足细胞EMT和凋亡的作用;2.明确BBR对lncRNA LOC102549726以及DN足细胞EMT和凋亡的调节作用;3.明确BBR是否通过调节lncRNALOC102549726相关信号通路来发挥DN大鼠肾脏保护作用。方法:1.不同高糖（high glucose,HG）刺激时间刺激足细胞后,使用qRT-PCR法检测 lncRNALOC102549726 的表达,筛选出 HG 刺激足细胞 lncRNALOC102549726上调的最佳时间点;2.将足细胞分为正常（Control）组和HG组,使用荧光原位杂交法（fluorescence in situ hybridization experiment,FISH）检测lncRNALOC102549726 在足细胞中的表达情况,确定lncRNALOC102549726在足细胞中的位置;3.转染lncRNALOC102549726过表达质粒和siRNA后,使用qRT-PCR法检测各组足细胞中lncRNALOC102549726的表达,Western Blot法检测各组足细胞中 EMT 相关蛋白（α-SMA、nephrin、vimentin）和凋亡蛋白（Bim）的表达,Transwell和划痕实验检测各组足细胞的迁移能力,流式细胞术检测各组足细胞的凋亡情况,研究lncRNALOC102549726对DN足细胞EMT和凋亡的作用;4.转染EGF的siRNA后,Western Blot法检测各组足细胞中EMT相关蛋白（α-SMA、nephrin、vimentin）和凋亡蛋白（Bim）的表达,qRT-PCR法检测各组足细胞EGF的表达,Transwell和划痕实验检测各组足细胞的迁移能力,流式细胞术检测各组足细胞的凋亡情况,研究EGF对DN足细胞EMT和凋亡的作用;5.使用GO及KEGG通路分析软件分析出与EGF相关的信号通路并进行验证,使用 Western Blot 法检测各组足细胞中 FOXO1、p-FOXO1、FOXO3、p-FOXO3、FOXO4和p-FOXO4的蛋白表达,使用qRT-PCR法检测各组足细胞中EGF和FOXO1的表达;6.不同浓度BBR给药后,使用CCK-8法检测各组足细胞的活力,使用qRT-PCR法检测各组足细胞中lncRNALOC102549726的表达,Western Blot法检测各组足细胞中EMT相关蛋白（α-SMA、nephrin、vimentin）和凋亡蛋白（Bim）的表达,Transwell和划痕实验检测各组足细胞的迁移能力,流式细胞术检测各组足细胞的凋亡情况,最终筛选出BBR给药的最佳浓度;7.对足细胞进行最适浓度BBR给药和沉默lncRNALOC102549726表达后,使用qRT-PCR法检测各组足细胞中lncRNALOC1025497 26、EGF和FOXO1的表达,Western Blot法检测各组足细胞中EMT相关蛋白（α-SMA、nephrin、vimentin）、凋亡蛋白（Bim）和通路蛋白（FOXO1、p-FOXO1）的表达,Transwell和划痕实验检测各组足细胞的迁移能力,流式细胞术检测各组足细胞的凋亡情况,研究BBR对DN足细胞EMT和凋亡的作用以及对lncRNALOC102549726及其相关信号通路的作用;8.建立DN大鼠模型,BBR给药8周后,检测各组大鼠的体重、空腹血糖（fasting blood sugar,FBG）值、肾功能指标、肾脏病理变化、肾小球超微结构的变化和肾皮质中 nephrin、α-SMA、vimentin、Bim、FOXO1、p-FOXO1、EGF 和lncRNALOC102549726的表达情况,研究BBR对DN大鼠的治疗作用。结果:1.HG刺激lncRNALOC102549726上调最佳时间点的选择qRT-PCR结果显示,与 Control 组相比,HG刺激24h 时,lncRNALOC102549726上调最明显,可作为刺激lncRNA LOC102549726上调的最佳时间点。2.LncRNALOC102549726在足细胞中的定位FISH实验结果显示,与Control组相比,lncRNALOC102549726在足细胞中高表达,且主要表达在足细胞的细胞质中。3.LncRNALOC102549726对DN足细胞EMT和凋亡的作用Western Blot结果显示,与Control组相比,HG组和过表达lncRNA LOC102549726组的nephrin的蛋白表达降低,Bim、α-SMA和vimentin蛋白表达升高,与HG组相比,小干扰lncRNALOC102549726组nephrin蛋白表达升高,Bim、α-SMA和vimentin蛋白表达降低;划痕实验结果显示,与Control组相比,HG组和过表达lncRNALOC102549726组的划痕愈合率增加,而与HG组相比,小干扰lncRNALOC102549726组划痕愈合率降低;Transwell实验结果显示,与Control组相比,HG组和过表达lncRNALOC102549726组迁移到下室的足细胞数增加,与HG组相比,小干扰lncRNALOC102549726组迁移到下室的足细胞数减少;流式细胞术结果显示,与Control组相比,HG组和过表达lncRNA LOC 102549726组足细胞凋亡率升高,与HG组相比,小干扰lncRNA LOC102549726组足细胞的凋亡率降低。4.EGF对DN足细胞EMT和凋亡的作用Western Blot结果显示,HG组α-SMA、vimentin和Bim的蛋白表达升高,nephrin蛋白表达降低,小干扰EGF组能降低α-SMA、vimentin和Bim蛋白表达,升高nephrin蛋白表达;划痕实验结果显示,HG组划痕愈合率增加,小干扰EGF组划痕愈合率降低;Transwell实验结果显示,HG组足细胞迁移到下室的数量增加,小干扰EGF组迁移到下室的足细胞数减少;流式细胞术结果显示,HG组足细胞凋亡率升高,小干扰EGF组足细胞凋亡率降低。5.LncRNALOC102549726及其靶蛋白EGF涉及的信号通路研究GO分析结合KEGG通路分析发现EGF的相关信号通路为FOXO信号通路。Western Blot结果显示,HG组足细胞中p-FOXO1的蛋白表达增加,p-FOXO3和p-FOXO4的蛋白表达无显著变化,与HG组相比,小干扰EGF组p-FOXO3和p-FOXO4的蛋白表达无显著变化,而p-FOXO1的蛋白表达明显降低。qRT-PCR结果显示,HG组和过表达lncRNALOC102549726组EGF mRNA表达升高,HG组FOXO 1 mRNA表达无明显变化,过表达lncRNA LOC102549726组FOXO 1 mRNA表达降低,小干扰lncRNA LOC102549726组的EGF mRNA表达降低,FOXO 1 mRNA表达升高;Western Blot结果显示,HG组和过表达lncRNA LOC 102549726 组 p-FOXO1 的蛋白表达升高,小干扰 lncRNA LOC 102549726 组p-FOXO1的蛋白表达降低。6.BBR给药最佳浓度的选择CCK-8结果显示,HG组足细胞活力降低,BBR（30μM）、BBR（60μM）和BBR（90μM）给药组能明显升高足细胞活力;qRT-PCR结果显示,HG组lncRNA LOC102549726 表达升高,BBR（60μM）组和 BBR（90μM）组能降低 lncRNA LOC 102549726 的表达;Western Blot 结果显示,HG 组 Bim、α-SMA 和 vimentin的蛋白表达升高,nephrin蛋白表达降低,BBR（90μM）组能降低α-SMA、vimentin和Bim的蛋白表达,升高nephrin的蛋白表达,BBR（60μM）组能降低Bim的蛋白表达,升高nephrin的蛋白表达,BBR（30μM）组仅能降低Bim的蛋白表达;划痕实验结果显示,HG组划痕愈合率增加,BBR（30μM）组、BBR（60μM）组和BBR（90μM）组均能降低足细胞的划痕愈合率;Transwell实验结果显示,HG组足细胞迁移到下室的数量增加,BBR（60μM）组和BBR（90μM）组能减少迁移到下室的足细胞数;流式细胞术结果显示,HG组足细胞凋亡率升高,仅BBR（90μM）组能降低足细胞的凋亡率。7.BBR缓解HG诱导的足细胞EMT和凋亡可能与抑制lncRNALOC102549726/EGF/FOXO1 信号通路相关qRT-PCR 结果显示,BBR（90μM）组和小干扰 lncRNALOC102549726 组能降低 lncRNA LOC102549726 表达和 EGF mRNA 表达,升高 FOXO 1 mRNA 表达;Western Blot 结果显示,BBR（90μM）组和小干扰 lncRNALOC102549726 组能降低α-SMA、vimentin、Bim和p-FOXO1的蛋白表达,升高nephrin的蛋白表达;划痕实验结果显示,BBR（90μM）组和小干扰lncRNALOC102549726组能降低足细胞的划痕愈合率;Transwell实验结果显示,BBR（90μM）组和小干扰lncRNA LOC102549726组迁移到下室的足细胞数减少;流式细胞术结果显示,BBR（90μM）组和小干扰lncRNALOC102549726组能降低足细胞的凋亡率。8.BBR对DN大鼠的治疗作用相应结果显示,BBR能降低DN大鼠的FBG值,调节肾功能指标,改善肾脏病理变化,升高肾皮质内nephrin的蛋白表达,降低α-SMA、vimentin、Bim和p-FOXO1的蛋白表达,升高肾皮质内FOXO1的mRNA表达,降低lncRNA LOC102549726的表达和EGF的mRNA表达。结论:1.LncRNALOC102549726的异常上调可影响DN足细胞EMT和凋亡。2.LncRNALOC102549726可通过靶向EGF影响FOXO1信号通路的表达进而调控DN足细胞EMT和凋亡。3.BBR可能通过抑制lncRNALOC102549726/EGF/FOXO1信号通路来缓解DN足细胞EMT和凋亡,从而改善足细胞损伤,发挥DN大鼠肾脏保护作用。