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第一部分 细胞焦亡关键蛋白Caspase-1在脑死亡大鼠肾脏损伤中的作用目的:研究细胞焦亡关键蛋白Caspase-1与脑死亡大鼠肾脏损伤的关系。方法选取雄性SD大鼠（250-300g）,将大鼠随机分成4组:1.脑死亡组（Group BD,n=30）:缓慢间断颅内加压法建立大鼠脑死亡模型,分别维持大鼠脑死亡状态0h、1h、2h、4h、6h（n=6）;2.假手术组（Group Sham,n=6）:无颅内加压过程,其余操作同脑死亡组;3.Caspase-1特异性抑制剂预处理脑死亡组（Group BD+Z-YVAD-FMK,n=30）:脑死亡模型建立前1h经静脉注射天冬氨酰半胱氨酰特异性蛋白酶-1（Caspase-1）特异性抑制剂Z-YVAD-FMK（300 ng/kg）其余操作同脑死亡组;4.Z-YVAD-FMK预处理假手术组（Group Sham+Z-YVAD-FMK,n=6）:术前1h经静脉注射Z-YVAD-FMK,其余操作同假手术组。获取不同时间点肾脏组织及血标本。肾脏组织进行免疫组化染色,病理损伤评分,透射电镜观察肾脏组织超微结构;实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测各组肾组织NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、Gasdermin 家族蛋白 D（GSDMD）、白介素-lβ（IL-1β）、白介素-18（IL-18）的mRNA水平,采用免疫印迹法（Western Blot）检测肾组织中 NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-1β和IL-18 的蛋白表达水平;检测各组血肌酐,尿素氮。结果血肌酐、尿素氮在大鼠脑死亡后4h、6h增高（P＜0.05）,肾脏病理损伤评分增高（P＜0.05）;与BD组相比,Z-YVAD-FMK+BD组血清中肌酐、尿素氮降低,肾脏组织病理损伤减轻,在脑死亡后6h病理损伤评分有统计学差异（P＜0.05）。免疫组化染色提示BD组大鼠肾脏组织Caspase-1、Caspase-11较假手术组高表达（P＜0.05）;Z-YVAD-FMK+BD组与BD组相比Caspase-1表达在两组间6h有统计学差异（P＜0.05）,Caspase-11表达在两组间无统计学差异。肾脏超微结构可见假手术组肾小管上皮细胞基本正常。BD组及Z-YVAD-FMK+BD组肾小管上皮细胞肿胀浑圆,细胞膜破裂,肾小管微绒毛脱落,细胞内线粒体数量增多且线粒体内嵴结构消失,部分线粒体有肿胀,自溶增多,线粒体膜结构消失,细胞核内容不均一,细胞核浓缩及染色体DNA的断裂、降解。Real-time PCR 结果表明 BD 组与假手术组比较,IL-1β、IL-18、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、NLRP3 mRNA表达在6h均升高,具有统计学差异（P＜0.05）;应用 Z-YVAD-FMK 预处理后 Caspase-1 及 IL-1β、IL-18、GSDMD、NLRP3 的 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）。Western Blot 结果显示,NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18在脑死亡后肾脏组织中表达升高,Z-YVAD-FMK预处理显著下调Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 蛋白表达（P＜0.05）,NLRP3 无明显差异。在脑死亡大鼠模型中,Caspase-11 mRNA水平和蛋白在脑死亡后6h表达均升高,有统计学差异（P＜0.05）,应用Caspase-1抑制剂后表达无差异。结论大鼠脑死亡状态下细胞焦亡相关的NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD在mRNA水平和蛋白水平高表达,细胞焦亡过程中释放的促炎因子IL-1 β、IL-18表达量增高,肾脏的病理损伤及功能损伤增加。应用Caspase-1抑制剂减轻了焦亡经典通路激活引起的肾脏损伤。本研究证实不论是细胞焦亡经典途径还是非经典途径,均参与了脑死亡状态下肾脏损伤,且细胞焦亡过程都需要GSDMD蛋白的活化;经典途径中NLRP3可以活化Caspase-1诱发细胞焦亡,Caspase-1抑制剂通过抑制细胞焦亡经典通路,对脑死亡大鼠的肾脏损伤有保护作用。细胞焦亡相关蛋白有望成为脑死亡肾脏损伤干预的潜在靶点。第二部分Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK对大鼠肾小管上皮细胞低氧复氧条件下细胞焦亡的调控作用目的探讨在低氧复氧条件下,细胞焦亡相关蛋白对大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）的作用。方法建立大鼠肾小管上皮细胞低氧复氧模型,NRK-52E细胞首先低氧培养（5%CO2,1%O2,94%N2）3h,之后复氧培养（5%CO2,21%O2,74%N2）。采用CCK-8检测各组细胞不同时间点的活性。采用Real-time PCR和Western Blot检测加Z-YVAD-FMK预处理后和siRNA敲低Caspase-11后不同时间点肾小管上皮细胞 NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18 的 mRNA 及蛋白表达。结果低氧复氧条件下可以明显降低肾小管上皮细胞的活性。Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK可以明显减轻低氧复氧对NRK-52E细胞的损伤;siRNA敲低Caspase-11对细胞活性无明显影响。低氧复氧条件下肾小管上皮细胞NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA 和蛋白水平显著上调;Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK预处理可以明显降低低氧复氧条件下NRK-52E细胞中 Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA 和蛋白表达,而 NLRP3、Caspase-11 mRNA 和蛋白无明显变化。siRNA 敲低 Caspase-1 1 后,Caspase-11、GSDMD mRNA 和蛋白表达明显降低,NLRP3、Caspase-1、IL-1 β、IL-18 mRNA和蛋白无明显改变。结论在低氧复氧条件下,大鼠肾小管上皮细胞中NLRP3、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18在mRNA水平和蛋白水平表达升高,细胞活性降低,而加入Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK抑制焦亡经典通路后减轻细胞损伤,抑制 Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA 和蛋白表达,而使用 siRNA 敲低Caspase-11抑制焦亡非经典通路后对细胞损伤没有影响,表明焦亡经典通路参与了 NRK-52E细胞低氧复氧后的损伤调控。