Rspo基因家族是新近发现的一个基因家族，包括4个家族成员，通过与胞膜蛋白FZD和LRP5/6相互作用而激活Wnt/β-catenin（β连环蛋白）信号途径，对细胞增殖分化、个体发育以及肿瘤的生长转移等进行调控。Rspo基因家族分布广泛，在不同物种中具有很高的保守性。Rspo基因尤其是Rspo3基因，通过基因敲除手段研究其功能的时候，敲除了Rspo3基因的小鼠不能正常发育成活体，揭示了 Rspo3基因在动物个体发育中起着极为关键的作用，但同时为进一步研究基因功能带来很大的障碍。通过对猪Rspo3基因的研究，对猪的新品种选育、疾病防治等都有重大的意义。　　本试验利用PCR的方法，克隆得到了猪Rspo3基因，检测了该基因的组织表达分布，并利用pET28a作为载体成功在大肠杆菌BL21中得到表达。为了进一步在真核细胞内研究Rspo3基因功能，构建了不同启动子组合的真核表达载体，并对不同载体的表达效率进行了筛选。　　1.利用电子克隆技术，设计了猪Rspo3基因的扩增引物，以猪的肝脏提取的总RNA为模板，利用RT-PCR成功获取了猪的Rspo3基因，经过测序确认，猪Rspo3的开放阅读框有828bp，编码275个氨基酸，其中包含56个酸性氨基酸和62个碱性氨基酸，蛋白质分子量为31.32 KDa，等电点为：9.94，并对猪Rspo3的三维结构进行了预测，蛋白分子三维尺寸为：X：44.486 Y：45.211 Z：47.410（单位：10-10米），属于球状蛋白质。Rspo3基因在猪各个组织表达分布检测表明：Rspo3基因除了在脾和脂肪组织中几乎很少表达外，其它常见组织中均有表达，其中在脑和睾丸表达丰度最高；　　2.将猪Rspo3基因整合到pET28a原核表达载体上，在Rspo3基因前添加了6×His-Tag，便于后期检测和纯化，利用大肠杆菌BL21作为宿主菌，优化后的猪Rspo3基因在大肠杆菌BL21中的表达条件为：温度26℃时，0.5mg/ml的IPTG浓度，诱导时间为2h。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot检测，确认成功表达了融合蛋白，分子量为35.19kDa；　　3.用酶切连接技术将Rspo3基因与10个不同启动子组合的真核表达载体（P1-P10）进行连接时，Rspo3自身所带的NcoI酶切位点成为正常的酶切连接反应的障碍。利用重叠延伸PCR的方法，先对猪Rspo3基因自身携带的NcoI酶切位点进行了同义突变，测序结果证实了突变获得了成功，除了突变位点，其它序列保持了不变，编码的氨基酸序列没有改变。利用亚克隆的方法，将突变后的Rspo3基因从T载体上NcoI和NheI双酶切后与P1-P10相连，经PCR、酶切和测序均验证正确，成功的构建了携带Rspo3基因的10个不同启动子组合的真核表达载体；　　4.在PK15细胞上的转染试验结果表明，GFP蛋白表达的效率最高的P5质粒，相对于对照组转染peGFP-N1质粒提高了458.9％，到第14天还能观测到GFP荧光，P6质粒的GFP表达效率仅次于P5质粒。用Q-PCR检测Rspo3效率P5质粒和P6质粒显著高于其它组，考虑到误差因素和检测目的分子的差异，最合适PK15细胞平台的启动子组合是P5质粒所携带的CMV(Human)+ HTLV RU5’（Viral）+ CMV(Human)；　　5.对鸡成纤维细胞DF1、犬肾细胞MDCK和人源的Hela细胞，也进行了不同启动子组合的筛选，对不同细胞转染结果通过荧光显微镜检测、GFP荧光吸光值测定和表达持续时间测定，在DF1细胞和MDCK细胞中表达效率最高的是P6质粒，启动子组合为启动子组合为CMV(Human)+ HTLV RU5’（Viral）+ Sv40(Viral)。而在Hela细胞上表达效率最高的是P5质粒，启动子组合为CMV(Human)+ HTLV RU5’（Viral）+ CMV(Human)。　　综上所述，本试验成功的克隆得到猪Rspo3基因，首次对该基因的不同组织表达分布进行了检测，在大肠杆菌BL21也成功获得了蛋白表达。构建了携带Rspo3基因不同启动子组合的真核表达载体，并对不同启动子组合的质粒在4种不同的细胞系上表达效率筛选，为进一步研究Rspo3的基因功能，促进其在理论研究及畜牧业中实际应用奠定了基础。