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为了预先了解由乙型肝炎的S蛋白和戊型肝炎的ORF2蛋白的羧基末端中的414-606aa的组成的融和目的蛋白质的结构和性质,以及为将来的实验做准备。我们通过相关在线网站和软件,研究了目的蛋白的等电点;结构域;氨基酸组成;分子量;可溶性;mRNA和蛋白质的二级结构;净电荷,亲水性和疏水性等,发现融合蛋白质的结构和性质并不影响其作为二价疫苗的抗原,这些预测结果为为我们将要进行的多项实验作好了必要的准备。
为构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价疫苗抗原的大肠杆菌高效表达载体。采用PCR方法扩增出S基因;采用PCR的方法扩增出ORF2编码区的羧基末端中的414-606aa的基因片段,经过T载体连接;菌落PCR;双酶切;southernblot;测序鉴定后,将这两部分重组入含有Q增强子的pTΩ-T7高效的E.coli表达载体中。构建了pTΩ-T7SE表达载体并且表达出相应的目的蛋白。这种方法为同时预防乙型和戊型肝炎提供了一个较好的途径。
为有效提高由乙型肝炎的S抗原基因和戊型肝炎的0RF2编码区的羧基末端中的414—606aa的基因片段构建的高效表达载体质粒pTΩ-T7SE在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达效率。通过对质粒稳定性;葡萄糖浓度;PH值;IPTG浓度:转接量;诱导时间;诱导温度;溶解氧对目的蛋白相对产量影响的研究,我们获得出了较好的培养方法,使目的蛋白相对含量达48.23﹪;菌体干重达0.5963g/L。通过以上研究,可以为大规模的发酵工艺提供部分依据。
利用乙型肝炎病毒adr亚型的S抗原基因和戊型肝炎病毒China-D亚型的ORF2编码区的羧基末端中的部分序列的构建的载体,在大肠杆菌中表达时,出现了大量包涵体,如何将包涵体进行洗涤,变性,复性,纯化,以提高资源利用效率,降低成本,提高产量,为进一步工业化生产疫苗用抗原作准备。我们以其为对象,对包涵体进行洗涤,变性,复性,金属亲和层析柱和凝胶过滤纯化后,蛋白的相对含量达98﹪。采用Western blot和ELISA对目的蛋白的活性进行检测,同时具有乙肝和戊型肝抗原活性。为其工业化生产提供了实验依据。