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第一部分:人脐带间充质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究 目的 探讨从人脐带组织分离、培养间充质干细胞(MSC)的方法,并对获取的MSC进行扩增、纯化,研究其基本生物学特性。 方法 无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带,以20ml注射器分别插入两根脐静脉及一跟脐动脉内,反复冲洗,冲去血管内的残存积血。组织剪将脐带剪碎,直至1mm~3大小组织块。直接将组织块接种于含DMEM/F12培养基或将组织块经酶消化法获取单个核细胞后接种于DMEM/F12培养基。进行原代培养,观察并记录其形态学变化。细胞达到融合状态时,消化传代进行纯化和扩增培养。用流式细胞仪检测MSC的细胞表面标志。绘制细胞生长曲线,通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入实验检测其增殖能力。流式细胞仪测定细胞周期。RT-PCR检测OCT-4 mRNA表达。透射电镜观察脐带MSC的形态和超微结构。 结果 两种分离方法均可获得成纤维样细胞。组织块贴壁法1周后于组织块间隙已可见散在分布的长条索状纺锤型细胞,3周左右细胞达到80%融合。胶原酶消化法,细胞接种后第2天即可见有少量形态各异的贴壁细胞,散在分布,1周左右时,贴壁细胞形成集落,占优势的是成纤维样细胞,及少量鹅卵石样细胞,至2周左右可达到80%融合。经传代培养后,可得到较为纯化的成纤维样细胞,细胞约每3天即可达到90%～95%融合,需再次传代或冻存,细胞可传代20代以上。分别对第3代、第5代、第10代脐带MSC行FACS检测,结果表明各代间免疫表型无明显差异,均强烈表达CD13、CD29、CD105、CD44,弱表达CD106,不表达CD14、CD34、CD11a、CD31、CD45。对第2、6、12代UCMSCs生长曲线进行分析,表明其倍增时间分别为33.1h、34.4h、34.65h。BrdU掺入实验中,