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寻找肿瘤特异性抗原对于肿瘤的诊断和治疗都具有重要的生理及现实意义。本论文主要研究了YWK-Ⅱ蛋白/APLP2作为一个潜在的肿瘤分子标志在肿瘤发生中的作用以及BAT3在这个过程中发挥的作用。
YWK-Ⅱ蛋白/APLP2是一种Ⅰ型精子膜蛋白,最初是由本组采用一株抗人精子膜蛋白的单克隆抗体对大鼠睾丸λgt11 cDNA文库进行筛选获得的,它定位于人精子头部的赤道区。序列分析发现YWK-Ⅱ蛋白/APLP2与Alzheimers病(老年性痴呆)相关的A4蛋白前体(APP)存在广泛的同源性和区域保守性,胞内区和跨膜区有70.6％的同源性。本室前期工作表明,该蛋白质在生精细胞中定位于细胞膜上,其抗体具有精子凝集活性以及抗生育作用。文献资料显示YWK-Ⅱ蛋白/APLP2参与调节细胞增殖和凋亡过程,缺失YWK—Ⅱ蛋白/APLP2的细胞对某些凋亡刺激剂的敏感性增强,临床观察发现在化疗药物处理后的一些恶性肿瘤中YWK-Ⅱ蛋白/APLP2蛋白表达增高。
为了进一步研究YWK-Ⅱ蛋白/APLP2体内生理功能,本室通过酵母双杂交系统寻找与之相互作用的蛋白质。结果显示,BAT3,一个在凋亡过程中发挥重要作用的蛋白质,与YWK-Ⅱ蛋白/APLP2相互作用。BAT3又称为Scythe、HLA-B associatedtranscript3或BAG6,缺失BAT3的小鼠在胚胎发育过程中表现出明显的器官形成缺陷,细胞生长阻滞以及凋亡增多。文献报道BAT3可以与黑腹果蝇中重要的凋亡调节因子Reaper相互作用并且调控它的功能,当BAT3与Reaper结合后可抑制Reaper释放出细胞色素C。
为了深入研究YWK-Ⅱ蛋白/APLP2和BAT3的相互作用以及这种相互作用可能介导的生理功能,本研究首先应用免疫共沉淀的方法证实体内YWK-Ⅱ蛋白/APLP2和BAT3能够相互作用。结果显示无论外源性YWK-Ⅱ蛋白/APLP2和BAT3或者内源性YWK-Ⅱ蛋白/APLP2和BAT3均可以相互作用。从氨基端到羧基端,BAT3的主要结构域包括泛素样结构域(Ubiquitin-like domain,UBL),富含脯氨酸结构域(Prolin-rich domain)以及BAG结构域。为了确定BAT3与YWK-Ⅱ蛋白/APLP2相互作用的区域,我们构建了一系列不同的BAT3截短体。结果显示BAT3主要依赖富含脯氨酸结构域与YWK-Ⅱ蛋白/APLP2相互作用。
越来越多的证据显示BAT3与相互作用蛋白结合后,可以显著提高作用蛋白质的水平。本研究发现YWK-Ⅱ蛋白/APLP2蛋白水平以剂量依赖性形式随着BAT3的增加而增加。当用CHX(一种蛋白质合成抑制剂)处理细胞后,表达BAT3可显著提高YWK-Ⅱ蛋白/APLP2蛋白的半衰期。这些结果提示BAT3可能抑制YWK-Ⅱ蛋白/APLP2的降解而影响YWK-Ⅱ蛋白/APLP2的水平。
众所周知,泛素蛋白酶体途径和吞噬溶酶体途径是体内负责蛋白质降解的两条主要途径,令人好奇的是YWK-Ⅱ蛋白/APLP2究竟通过哪条途径被降解?BAT3如何抑制这种降解?本研究发现,当用蛋白酶体抑制剂MG132或溶酶体抑制剂氯喹处理细胞后,YWK-Ⅱ蛋白/APLP2的蛋白水平显著提高。CHX追踪实验表明MG132和氯喹均显著增强YWK-Ⅱ蛋白/APLP2的稳定性,这些结果表明体内YWK-Ⅱ蛋白/APLP2同时被泛素蛋白酶体途径和吞噬溶酶体途径这两条途径所降解。与此同时,本研究发现MG132处理细胞后体内YWK-Ⅱ蛋白/APLP2泛素化增加,而且re-IP实验也证实MG132可以增加YWK-Ⅱ蛋白/APLP2泛素化,这些结果证实体内存在泛素化形式的YWK-Ⅱ蛋白/APLP2。当外源表达BAT3时,以泛素化形式存在的YWK-Ⅱ蛋白/APLP2明显减少。因此我们的结果证实BAT3可以通过抑制YWK-Ⅱ蛋白/APLP2的泛素化而减少YWK-Ⅱ蛋白/APLP2的降解,增加YWK-Ⅱ蛋白/APLP2的稳定性,提高YWK-Ⅱ蛋白/APLP2蛋白水平。
本室前期工作中发现YWK-Ⅱ蛋白/APLP2参与调控细胞生长以及凋亡过程。本研究运用Real-time PCR和Western blotting方法比较了正常胰腺组织以及五株胰腺癌细胞中YWK—Ⅱ蛋白/APLP2 mRNA及蛋白质表达的差异。结果发现,五株胰腺癌细胞中YWK-Ⅱ蛋白/APLP2 mRNA及蛋白质的表达均较正常胰腺组织高。此外,应用组织芯片技术验证了YWK-Ⅱ蛋白/APLP2蛋白在胰腺癌组织中表达水平比正常胰腺组织蛋白水平明显增强。这些结果提示YWK-Ⅱ蛋白/APLP2蛋白可能参与胰腺癌的发生发展过程。
在本研究中,通过将表达YWK-Ⅱ蛋白/APLP2 RNAi的慢病毒感染胰腺癌ASPC-1细胞和结肠癌HCT116细胞,成功构建YWK-Ⅱ蛋白/APLP2消减的稳定细胞株。我们发现用UV照射细胞后,检测凋亡标记分子caspase3和PARP,结果显示与对照组相比,YWK—Ⅱ蛋白/APLP2 RNAi组细胞切割的caspase3和PARP都明显增多,提示YWK-Ⅱ蛋白/APLP2被消减后可以增加细胞对凋亡的敏感性。而本室前期工作同时表明过表达YWK-Ⅱ蛋白/APLP2可以抑制CHX诱导的细胞凋亡。这些结果提示YWK—Ⅱ蛋白/APLP2可能通过抑制细胞凋亡而参与肿瘤发生。我们应用凋亡诱导剂CPT刺激HCT116细胞或小鼠精原细胞GC-1,发现YWK-Ⅱ蛋白/APLP2随着凋亡的进行先升高后降低。与对照组相比,过表BAT3可以明显提高YWK-Ⅱ蛋白/APLP2在凋亡过程中的表达,这些结果提示在凋亡早期阶段,YWK-Ⅱ蛋白/APLP2表达增高可作为体内的一种拮抗凋亡、自我保护的途径。
基于以上研究结果,我们感兴趣的是BAT3在人体内肿瘤发生过程中是否也能介导相似的生理过程。我们检测了六例人结直肠癌组织和人正常结直肠组织中这两种蛋白质的表达,亦显示在前者中YWK-Ⅱ蛋白/APLP2和BAT3的表达不同程度地高于后者,这两种蛋白质之间呈现正相关性,提示在肿瘤发生中BAT3水平增高,提高YWK-Ⅱ蛋白/APLP2表达,导致肿瘤细胞拮抗凋亡,从而参与了肿瘤的发生发展。
此外,在学习期间,以免疫印迹方法检测了Nrdpls蛋白(Nrdpl的一种剪接体)在小鼠不同组织中的表达,发现Nrdpls在所检测的大部分小鼠组织中表达,并且在脑、皮肤、膀胱等组织中呈相对较高的表达。通过免疫共沉淀实验我们发现Nrdpls可以和Nrdpl相互作用,而且Nrdpls还可以和SIP相互作用,这就提示Nrdpls可能通过与Nrdpl相互竞争结合底物而拮抗Nrdpl的作用。我们应用凋亡刺激剂诱导GC-1,发现Nrdpls在凋亡过程中先升高后降低,结合此前的研究结果,表达Nrdpl可以促进细胞凋亡,我们推测在凋亡早期,细胞通过升高Nrdpls蛋白水平拮抗Nrdpl的功能而阻滞凋亡的进行。