肝癌患者在世界上的数量逐渐增加,死亡率也极高,尤其是在中国,这对人类的生命和健康构成了严重的威胁。我国是有着悠久历史的中药大国。因此,治疗肝癌最快捷的方法是从天然化合物中找到可用的抗肝癌药物。沙蟾毒精(Arenobufagin,ArBu)就是一个天然的具有较强抗肝癌作用的单体化合物。研究表明,针对肝癌细胞,ArBu不仅可以抑制其增殖、侵袭及转移,还能诱导其凋亡。肿瘤细胞主要经NF-κB与MAPK信号通路调节其侵袭过程,将细胞周期阻滞于G2/M期从而抑制其增殖生长。ArBu可通过调节PI3K/Akt/mTOR途径引起HeβG2细胞的自噬与凋亡。但是关于ArBu抗肝癌时对生命体中的蛋白质、脂质及神经递质等内源性分子的调节作用还不是很清楚,亟需深入的研究。随着液质联用技术(LC-MS/MS)及系统生物学的快速发展,为基于多组学的网络关联分析及潜在生物标志物的挖掘提供了强有力的保障。去甲斑蝥酸钠(Sodium Norcantharidate,NCTD-Na)也是一个动物类的中药,与ArBu相似的是它也具有抗肝癌作用。于是,本课题将两个单体同时研究,以便比较二者抗肝癌机制的异同。斑马鱼由于具有早期胚胎透明、体型小、与人类基因相似度高、繁殖能力强等优点,已被广泛用于药物的开发利用中。本研究成功地建立了斑马鱼HepG2异种移植模型,并在此基础上进行了药效学及脂质组学的初步研究。此外,在去除斑马鱼HepG2异种移植模型本底的基础上,进行了ArBu体外抗肝癌(HepG2细胞)的系统研究。其主要有蛋白质组学的研究、关键差异蛋白的验证、脂质组学的研究、神经递质的研究以及基于系统生物学的联合分析等。基于裸鼠HepG2异种移植模型体内药效学实验再次证明了ArBu的抗肝癌作用。ArBu具有较好的抗肝癌作用,其狭窄的治疗窗及对内源性物质的干预机制严重的限制了其成为抗肝癌药物应用于临床的道路,所以迫切地需要采用基于LC-MS/MS平台的多组学技术对其内源性物质的调控机制进行研究,尤其是脂质稳态的研究,与肝癌的发生发展更为密切。本研究发现了大量的差异脂质、差异蛋白以及差异神经递质,为深入认识ArBu的抗肝癌机制提供了科学依据。一、沙蟾毒精抗肝癌疗效评价运用斑马鱼HepG2异种移植肿瘤模型初步评价ArBu抗肝癌的疗效,通过荧光定量法研究ArBu对斑马鱼体内异种移植肿瘤的抑制效应,为该模型的脂质组学研究提供浓度依据和药效学基础。采用正常斑马鱼确定ArBu的最大耐受浓度,选取1/9和1/3最大耐受浓度作为研究对象。斑马鱼的HepG2异种移植模型是通过使用显微注射仪将CM-DiI标记的HepG2细胞注射到2 dpf斑马鱼的卵黄囊内建立的。当斑马鱼3 dpf后,利用荧光显微镜将荧光量较为相似的斑马鱼挑选出来。给药顺铂(阳性药)和ArBu后,每组随机选择10尾鱼观察、拍照并进行图像数据的分析,定量分析每条斑马鱼的总荧光强度,并计算其相对荧光强度总和。研究结果表明,ArBu对正常斑马鱼的最大耐受浓度为0.01 μg·mL-1。14.9μg·mL-1的顺铂作为阳性药对斑马鱼HepG2移植瘤模型的抑制率为26%,而1/9 MTC(0.0011μg.mL-1)和 1/3MTC(0.003μg·mL-1)的 ArBu 对斑马鱼 HepG2移植瘤模型的抑制率分别为29%和46%。为了进一步验证ArBu体内的抗肝癌药效,建立了裸鼠HepG2异种移植模型。从肿瘤体积、肿瘤重量及抑瘤疗效等多方面对ArBu抗肝癌效果进行评价。目的是:一方面确定ArBu对裸鼠HepG2异种移植模型的体内药效,另一方面将该药效结果与斑马鱼HepG2异种移植肿瘤模型的药效结果进行比较,以便获取更多ArBu抗肝癌的药效数据。方法是预先选取一定数量的裸鼠,将HepG2细胞接种于其右后背的皮下,待肿瘤体积达到一定程度时,将其取出并切成小块接种到新的裸鼠腋下建立裸鼠HepG2异种移植模型,7天后剔除未成瘤的,随机分组并给药ArBu 21天,定时检测肿瘤的体积、重量及其抑瘤效果。研究表明,模型对照组中的荷瘤小鼠的肿瘤体积给药21天后达到1361.97 mm3。15 mg/kg-ArBu 组与 45 mg/kg-ArBu 组肿瘤体积分别为 756.16 mm3 和 736.85 mm3(P<0.05),TGI值分别为47%和51%,说明ArBu能显著地抑制体内肿瘤的生长。二、基于脂质稳态调控的沙蟾毒精抗肝癌作用机制研究以斑马鱼HepG2异种移植模型为研究对象,以LC-MS/MS为技术依托进行靶向与非靶向相结合的综合脂质组学研究,以阐释ArBu抗肝癌时对脂质稳态的调节作用。两种分析方法共同使用,有利于寻找更多、更可靠的潜在生物标志物。靶向分析主要是基于脂质标准品数据库通过Skyline软件提取保留时间和特征离子等参数完成。非靶向分析主要是利用Progenesis QI软件进行数据处理,通过SIMCA 14.1软件进行统计分析,经HMDB和LIPIDMAP等数据库鉴定完成。在斑马鱼HepG2异种移植瘤模型中,靶向脂质分析共发现16个差异脂质,其中8个PC,7个PE和1个SM。非靶向脂质分析共发现13个差异脂质,其中8个PC,4个TG和1个PE。二者有5个共同的脂质,他们分别是:PC(22:6/16:0),PC(18:2/16:0),PC(20:4/20:3),PC(20:3/16:0)和 PE(22:6/16:0)。所以该脂质组学研究共发现24个潜在的脂质生物标志物。将差异脂质在MetaboAnalyst网站上进行分析,发现甘油磷脂代谢通路是ArBu主要影响的代谢通路。为了进一步探索ArBu抗肝癌的作用机制,以HepG2细胞为研究对象进行脂质组学验证的同时进行蛋白质组学的研究,以便将得到的差异脂质与差异蛋白进行多组学网络关联分析,从整体上寻找ArBu抗肝癌作用机制的突破口,阐释ArBu抗肝癌可能的代谢通路。神经递质等小分子的代谢与肝癌的发生发展密切相关,多组学研究的同时也对HepG2细胞内给药前后神经递质的变化进行了测定,进一步辅助解释ArBu抗肝癌时对内源性物质的调节作用。HepG2细胞更加纯净,没有斑马鱼HepG2异种移植模型复杂的生物体背景,更适合ArBu抗肝癌作用机制的研究。借以LC-MS/MS平台进一步探索ArBu对细胞内大分子蛋白质、小分子脂质及神经递质的调节状况。通过以上手段筛选得到的差异蛋白、差异脂质及差异神经递质可以在单一水平或多水平上进行比较分析。同时,这些内源性的差异代谢物可作为潜在的生物标志物进行进一步的验证。在ArBu的HepG2细胞脂质组学研究中,原始数据经OPLS-DA分析,得相关载荷图(S-plots)。以P<0.05,VIP(Variable Importance in the Projection)>1及组内RSD<30%为筛选条件进行两组之间的比较,结果发现,对照组与低剂量组之间共有470个差异脂质,对照组与高剂量组之间共有167个。当对照组、ArBu低剂量组及ArBu高剂量组三组进行比较时,满足VIP>1,P<0.05,组内RSD<30%并呈ArBu剂量依赖的差异脂质共计81个。最终选取MFC>1.5或<0.7的差异脂质作为潜在的生物标志物,共计24个,分别是12个PCs,4个DGs,2个PEs,2个SMs,2个TGs,1个Cer和1个PA。其中呈ArBu剂量依赖性上升的差异脂质有多不饱和PC、PE、SM、TG、Cer;呈剂量依赖性下降的差异脂质有饱和/单不饱和PC、DG、PA。甘油磷脂代谢通路也是ArBu对HepG2细胞影响的主要途径。利用iBAQ软件对ArBu作用的HepG2细胞进行无标定量蛋白质组学研究,满足组内RSD<30%且ArBu剂量依赖的差异蛋白有921个。经过Mev.4.9.0软件处理并经ANOVA检验,将ArBu低剂量组与ArBu高剂量组分别与对照组进行比较,发现均符合P<0.05差异蛋白有521个。选取521个蛋白进行进一步的分析,即筛选最大组间表达量差异比率2.0以上或0.5以下,同时结合uniprot数据库对差异蛋白进行功能注释且选取丰度较高的,结果共得到41个差异表达蛋白。研究发现差异蛋白主要参与细胞自噬、凋亡信号通路调节、细胞发育、信号转导、细胞周期、细胞表面受体信号通路、细胞代谢、酶联受体蛋白信号通路、细胞凋亡、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、蛋白磷酸化、细胞增殖调节、DNA修复、磷酸化调节、细胞成分组织、RNA合成与代谢、坏死过程调节、程序性细胞死亡调节、肿瘤坏死因子反应等生物学过程。本实验利用KEGG数据库探索差异蛋白可能参与的信号通路。结果发现,其主要参与癌症通路、内质网蛋白加工、内吞作用、p53信号通路、半胱氨酸、蛋氨酸及谷胱甘肽代谢、精氨酸和苏氨酸等氨基酸相关代谢、氨基酸生物合成等。基于网络分析,发现TSPO、STAT3、RPS27和LCLAT1差异蛋白与肝癌的进程密切相关,经RT-PCR验证,结果与蛋白质组学一致,均呈剂量依赖性下降。采用 Agilent1290 LC-Agilent 6490 QQQ-MS 仪器对 HepG2 内的 29 种神经递质进行了检测,结果发现HepG2细胞内的7种氨基酸明显过表达,它们分别是精氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酸和苏氨酸。当ArBu干预HepG2细胞24小时后,7种氨基酸的含量均下降一半左右(48%-58%),但是除了谷氨酸其它均不呈剂量依赖关系。三、基于脂质稳态调控的去甲斑蝥酸钠活性评价及抗肝癌作用机制研究本课题在研究ArBu抗肝癌疗效及作用机制的同时,也对去甲斑蝥酸钠(NCTD-Na)进行了相关研究。主要是对HepG2细胞和L02细胞的抑制作用、脂质组学及蛋白质组学(仅HepG2细胞)进行了初步的探讨,以便将ArBu与NCTD-Na两个抗肝癌单体药效及机制进行比较,挖掘二者抗肿瘤作用的异同。采用LC-MS/MS技术对NCTD-Na在HepG2细胞中的脂质组学和蛋白质组学进行检测分析,同时还进行了 NCTD-Na在L02细胞中的脂质组学研究。将二者的差异脂质进行比较及代谢通路的分析,从而比较二者抗肝癌作用机制的异同。NCTD-Na在HepG2细胞中的脂质组学研究,经筛选鉴定共得到40个显著性差异脂质,它们分别是:DG18个、MG 8个、PC 6个、Cer3个、SM2个及PE、TG和PA各1个。NCTD-Na在L02细胞中的脂质组学研究,经筛选鉴定共得到32个潜在生物标志物,它们分别是LysoPE 10个、LysoPC5个、DG4个、PC 3 个、Cer 3 个、SM1 个、PE 1 个、PA 1 个、LysoPA 1 个、PG 1 个、FAHFA 1个和PS 1个。二者影响的代谢通路均是甘油磷脂代谢通路,同时这也提示NCTD-Na与ArBu主要影响的代谢通路也是一样的。综上所述,ArBu对两种肝癌模型,即斑马鱼HepG2异种移植模型和裸鼠HepG2异种移植瘤模型,均表现出一定的抗肝癌作用。本研究对斑马鱼HepG2异种移植模型进行了体内脂质组学的研究,同时也对HepG2细胞进行了体外脂质组学的分析,基本上阐明了 ArBu对生命体脂质稳态的影响。其中ArBu对肝癌模型主要影响的脂质类别有PCs,PEs,TGs,SMs和Cers等,主要影响的脂质代谢通路是甘油磷脂代谢通路。此外,基于HepG2细胞的蛋白质组学分析及其与脂质组学的关联分析,找到了 ArBu主要影响的关键蛋白,如TSPO、STAT3、RPS27和LCLAT1等。同时,也发现了 ArBu抗肝癌过程中主要影响的7种胞内氨基酸,即精氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酸和苏氨酸。ArBu和NCTD-Na均能调节HepG2细胞的脂质稳态,二者既有相似又有不同。ArBu和NCTD-Na二者主要影响的代谢通路均是甘油磷脂代谢通路。