日本鳗鲡干扰素调节因子11(IRF11)的转录调控及功能的初步研究

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干扰素调节因子(Interferon regulatory factors,IRFs)是一类重要的转录因子,可结合干扰素(Interferon,IFN)和干扰素诱导基因(Interferon-stimulated gene,ISG)的启动子区调控其表达,在抗病毒、抗肿瘤,细胞增殖和凋亡等过程中发挥着重要的作用。至今,在鱼类中已报道了11个IRF家族成员,即IRF1-11,其中IRF11为硬骨鱼类中所特有的。本论文以日本鳗鲡为研究对象,对其IRF11的功能特征进行了初步探讨,主要结果如下:克隆获得了日本鳗鲡IRF11基因(AjIRF11),其cDNA全长1321 bp,编码281个氨基酸,蛋白分子量理论值为31.97 kDa。序列分析结果显示,AjIRF11属于IRF1亚家族成员,其DBD结构域包含6个保守的色氨酸残基。基因共线性分析结果显示,AjIRF11的上游基因和下游基因分别为CHS1和KIF1BP,其下游基因链与腔棘鱼和斑点雀鳝IRF11下游基因链一致,在棘鳍类中,IRF11基因均位于IL4R.1和NIP7基因之间,推测IRF11基因可能在硬骨鱼类进化过程中经历了谱系特异性的基因组重组事件。荧光定量PCR结果显示,AjIRF11主要在鳃中表达,爱德华氏菌感染后8 h,鳃中AjIRF11的转录表达量上调了3.6倍,感染72 h后,鳃和肠道中AjIRF11的转录表达量分别上调了4.04倍和1.4倍。而在poly I:C刺激的日本鳗鲡各组织/器官中,IRF11的转录表达量无显著变化。克隆获得了AjIRF11启动子区域,并通过转录因子数据库进行比对分析。结果显示,AjIRF11启动子区域有若干个SP1结合位点和NF-κB结合位点,并没有发现ISRE基序和GAS位点。构建了AjIRF11启动子报告质粒,构建了日本鳗鲡IRFs,STATs,以及RLRs和TLRs信号通路上的关键作用因子的真核表达质粒,并分别利用双荧光素酶报告系统检测了过表达转录因子、信号通路相关基因等对AjIRF11启动子荧光素酶活性的影响。结果显示过表达组与对照组无显著差异。免疫荧光分析结果显示,AjIRF11定位在细胞核中。我们对其序列进一步分析,并利用免疫荧光进行验证后发现,AjIRF11拥有两个核定位信号,其中NLS1为75KTWKANFR8297KSIKK101为由两簇碱性氨基酸构成的bipartite NLS,在引导AjIRF11入核过程中起着关键作用,而NLS2(119KRRK122)为由单簇碱性氨基酸构成的monopartite NLS,发挥辅助入核的作用。此外,我们构建了日本鳗鲡干扰素(AjIFNs-pro)和Mx基因(AjMxs-pro)的启动子报告质粒,利用双荧光素酶报告系统检测了AjIRF11对AjIFNs-pro和AjMxs-pro的调控作用。结果显示,过表达AjIRF11能够显著激活AjIFNs-pro和AjMxs-pro启动子的活性。利用荧光定量PCR检测了AjIRF11对鱼类抗病毒相关基因的调控作用,发现过表达AjIRF11能显著诱导EPC细胞抗病毒相关基因IFNa,Mx1,PKR,Viperin,ISG15基因的上调表达。综上所述,本研究克隆获得了日本鳗鲡IRF11基因cDNA全长序列,并对日本鳗鲡IRF11的组织表达和转录机制、亚细胞定位和在免疫应答中发挥的作用做了初步研究。本论文为全面、系统地揭示IRF11在鱼类天然免疫中的功能奠定了基础。
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