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天然防腐剂也称天然有机防腐剂,是由生物体分泌或者体内存在的具有抑菌作用的物质。此类防腐剂为天然物质,有的本身就是食品的组分,故对人体无毒害,并能增进食品的风味品质,因而是一类有发展前景的食品防腐剂。乳酸菌(LAB)作为目前世界公认的食品级微生物,它们代谢产生的抗菌物质可作为天然的食品防腐剂直接应用于食品工业。苯基乳酸(phenyllactic acid,PLA),即2-羟基-3-苯基丙酸,作为乳酸菌的代谢产物之一,广泛存在于乳酸菌发酵产品。大量研究表明苯基乳酸是一种广谱的抗菌物质,对大多数革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌都有很好的抑制效果,抑菌活性强于一些常用的食品防腐剂,如苯甲酸钠、山梨酸钾等。近年来陆续有文章报道利用乳酸菌,例如Lactobacillus plantarum,Enterococcus faecalis和Pediococcus acidilactici合成苯乳酸的研究。在乳酸菌的代谢过程中,苯丙氨酸(Phe)经过转氨反应转化成为苯丙酮酸(PPA),然后苯丙酮酸通过乳酸脱氢酶(LDH)还原生成苯基乳酸。乳酸脱氢酶作为转化苯丙酮酸生成苯乳酸的关键酶,在微生物体内的表达受到严格调控而致使胞内乳酸脱氢酶含量较低,限制了苯基乳酸产量的提高。因此,利用基因工程技术构建高效表达乳酸脱氢酶的工程菌来提高苯基乳酸产量是极具发展潜力的一种方法。乳酸脱氢酶是NADH依赖型氧还原酶。催化过程中需要不断消耗体系中的还原型辅酶(NADH),还原型辅酶的额外添加会使成本显著增加。因此开发系统中还原型辅酶再生的方法亦是研究的关键。酶耦联法是常用的辅酶再生的方法,在反应体系中共表达底物催化酶和辅酶循环酶两种酶,但辅酶在两个酶分子间传递,有可能造成辅酶利用效率不高。利用基因融合策略构建双功能酶有可能使两个酶的活性位点接近,使辅酶在分子内高效传递从而提高催化效率。本论文将D-乳酸脱氢酶(D-LDH)与甲酸脱氢酶(FDH)进行融合表达,构建D-LDH-Linker-FDH双功能融合蛋白,在以苯丙酮酸为底物不对称合成D-苯基乳酸(D-PLA)的反应中,实现辅酶因子的原位再生,使转化反应能够继续进行,获得高产量的D-苯基乳酸。主要的研究成果如下:(1)用Over-lap extension PCR法将D-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶基因连接起来。为了防止两段基因互相干扰,我们在两段基因间引入不同的Linker片段。目的基因经测序验证正确后克隆至表达载体pET-28a(+)并导入宿主菌。重组大肠杆菌在IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测,结果表明重组菌在近78 kDa处有明显蛋白条带,相对分子质量和预期的大小一致,表明融合蛋白在大肠杆菌中表达成功。酶活测定结果显示包含四种不同Linker的融合蛋白D-LDH-Linker-FDH均具有D-LDH和FDH双重生物学活性,融合表达的D-LDH活性是游离表达的D-LDH的34.25-47.47%,融合表达的FDH的活性和游离表达的FDH活性相近。(2)在测定融合蛋白粗酶乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶生物学活性的试验中,验证得到融合蛋白对苯丙酮酸具有催化活性,构建的重组菌具有催化苯丙酮酸合成苯基乳酸的能力。菌株E.coli pET-28a-d-ldhY52V-s1-fdh、E.coli pET28a-d-ldhY52V-s2-fdh和E coli pET28a-d-ldhY52V-e-fdh通过正交实验获得的最优诱导条件组合为:诱导时机为菌体浓度OD600达到1.0时添加诱导剂,诱导时间为12h,诱导温度为25℃,诱导剂浓度0.2 mmol/L。菌种E.coli pET28a-d-ldhY52V-g-fdh通过正交实验获得的最优诱导条件组合为:诱导时机为菌体浓度OD600达到1.0时添加诱导剂,诱导时间为12 h,诱导温度为25℃,诱导剂浓度0.1 mmol/L。通过正交实验优化后诱导的四种重组菌合成苯基乳酸的产量较原来提高10.28%-21.1%之间不等。(3)对转化反应体系和过程进行优化,优化后最佳的单批次转化条件为:反应体系pH 7.0,转化温度37℃,底物浓度12 g/L。在最优的诱导条件和转化条件下,与重组菌E.coli pET-28a-d-ldhY52V相比,能够实现辅因子再生的重组菌E.coli pET-28a-d-ldhY52V-s1-fdh、E.coli p ET28a-d-ldhY52V-s2-fdh、E coli pET28a-d-ldhY52V-e-fdh和E.coli pET28a-d-ldhY52V-g-fdh在转化生产苯基乳酸能力上均有不同程度的提升,其中由钢性Linker(EAAAK)连接的融合蛋白具有较强的催化活力,苯基乳酸产量显著提高48.34%,达到单批次生产量6.72 g/L。为了进一步提高包含融合蛋白的重组菌全细胞转化苯丙酮酸生产苯基乳酸的能力,在最优的诱导条件和转化条件下通过间断补充底物、葡萄糖和甲酸钠进行分批补料培养,并且采取反应过程中保持反应体系恒定pH的方式提高苯基乳酸的产量,最终获得苯基乳酸产量18.6 g/L,生产强度为4.65 g/L/h,转化率达到78.84%。