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癌症是影响全世界人口死亡率的重要因素,根据世界卫生组织2018年发布的全球癌症统计报告,在所有癌症发病率中,肝癌发病率排名第六,且是第四大与癌症相关的死亡原因,且世界卫生组织估计,截止2030年将有100多万患者死于肝癌,肝癌发病率高,病死率高,5年存活率仅能达到18%,控制肝癌的发病率,提高存活率是医学界的重大挑战。基因表达、突变和途径相互作用分析等生物信息学数据的集成是近年来医学基因组学研究的一个趋势,个性化肿瘤学的机器学习方法也呈现了当前医学基因组学研究的趋势,分析人类疾病的生物信息学工具在医学基因组学这一特殊问题的需求量很大,近十年来,生物信息学方法被广泛应用于解释测序数据,预测药物敏感性（或耐药性）,最终指导精确的药物选择。FOXK1转录因子在各种组织和器官中普遍表达,在高等生物的细胞功能中起着至关重要的作用。在哺乳动物中,FOXK家族包括两个成员,即FOXK1和FOXK2,FOXK家族参与调节细胞增殖、存活、骨骼肌再生和成肌分化等,并在多种肿瘤中发挥致癌作用,例如结直肠癌、胃癌、食道癌、卵巢癌和肺癌以及胶质母细胞瘤等,肝癌中FOXK1也表现出致癌性,但FOXK1在肝癌中的报道较少,为了进一步阐明FOXK1对肝癌恶行行为的影响及其机制,本研究以FOXK1为出发点,探讨FOXK1在肝癌中的作用及其作用机制。目的1.基于生物信息学方法分析FOXK1在原发性肝癌的临床价值,并预测FOXK1调节肝癌发生发展的潜在方式及机制;2.通过肝癌组织芯片免疫组化的结果评估FOXK1在原发性肝癌患者中临床预后价值并对生物信息预测加以验证;3.FOXK1对肝癌细胞EMT及自噬的影响及其机制探讨。方法1.生物信息学预测:先用在线数据库预测FOXK1在肝癌及正常肝组织中的mRNA及蛋白水平的表达差异,然后整合FOXK1表达量与对应临床资料,通过单因素及多因素Cox回归分析预测FOXK1对TCGA-LIHC患者的临床预后价值,并构建临床预测模型。通过ssGSEA分析FOXK1在肝癌免疫微环境中的调节作用及其对免疫治疗的预测价值,通过GSEA、GO和KEGG富集分析预测FOXK1影响肝癌发生发展的方式和机制;2.临床样本验证:通过肝细胞癌组织芯片免疫组化分析FOXK1蛋白在肝癌和邻近癌旁组织中的表达差异,及其与PD-L1、CTLA-4蛋白表达的相关性,通过单因素和多因Cox回归分析FOXK1与肝癌预后（总生存期和无瘤生存期）的相关性,通过卡方检验分析FOXK1与肝细胞癌患者的临床相关性;3.体内体外实验验证:体外实验通过shNC和shFOXK1慢病毒感染细胞构建稳转的HepG2肝癌细胞株,通过细胞划痕、transwell、细胞黏附实验、免疫荧光、RT-PCR和WB验证FOXK1对HepG2EMT的影响,通过免疫荧光、透射电镜、RT-PCR、WB验证FOXK1对HepG2自噬的影响,加入自噬抑制剂氯喹,通过细胞划痕、细胞黏附及WB实验探索FOXK1抑制诱导的自噬对HepG2细胞EMT的影响;体外实验通过裸鼠皮下成瘤实验验证FOXK1对HepG2细胞EMT及自噬的影响。结果1.基于 TCGA、GEO（GSE36376 和 GSE112790）、TCGA+GTEx 及 THPA 数据库分析的结果,FOXK1 mRNA及蛋白在肝癌组织的表达明显高于正常肝脏组织或邻近癌旁组织,FOXK1对TCGA-LIHC诊断的ROC曲线下面积达94.8%,诊断灵敏度达83.96%,特异度高达98%,而AFP诊断TCGA-LIHC的灵敏度仅为50.53%,特异性为94%,根据FOXK1 mRNA的中位数将患者分为高低两组,K-M曲线结果显示高FOXK1与TCGA-LIHC患者低OS、PFS及DFS密切相关,FOXK1表达与病理分期,组织学分级,肿瘤大小呈现正相关,FOXK1高表达患者肿瘤复发率明显高于FOXK1低表达患者。结合单因素和多因素Cox的回归分析,结果提示FOXK1是影响TCGA-LIHC患者预后独立的危险因素,并通过ICGC数据库验证了这一结果;2.在肝癌中FOXK1参与了细胞粘附连接、凋亡和胞吞等过程,且与ERBB、Wnt、NOTCH和mTOR等信号通路的激活密切相关;FOXK1表达量与自噬相关基因（包括SQSTM1,BECN1 and MAP1LC3B）及EMT相关基因（包括CDH1,CDH2,VIM,MMP3 and MMP9）均存在相关性,PI3K/AKT 信号通路在FOXK1对肝癌EMT和自噬的调节作用中均有显著富集;3.ssGSEA分析结果显示,FOXK1高表达组具有丰富的CD4+T和树突状细胞浸润,低表达组具有丰富的CD8+T、嗜酸性和中性粒细胞浸润,两组在其他免疫细胞浸润程度上未见显著性差异,IPS结果预测指出FOXK1低表达患者使用抗CTLA-4可能有更好疗效,FOXK1高表达患者对PI3K/AKT通路抑制剂AZD8055、A-443654、AZD6482和雷帕霉素的药物敏感性可能更高;4.在90例肝细胞癌患者组织芯片中,FOXK1蛋白在肝癌组织中的表达明显高于邻近癌旁组织,且FOXK1与PD-L1表达呈正相关,FOXK1高表达患者的总体生存期及无瘤生存期明显缩短,此外FOXK1表达与肝癌病理分级、肝硬化结节数目及血清AFP水平呈正相关,单因素多因素Cox结果显示,无论是总体生存率还是无瘤生存率,高FOXK1均可作为影响肝癌患者预后独立的危险因素;5.相比较人正常肝细胞L02,FOXK1在肝癌细胞株HepG2及Huh7中均有显著高表达,FOXK1表达抑制后,HepG2迁移侵袭能力减弱、细胞黏附能力下降,E-cadherin表达增加,N-cadherin和Vimentin表达减少;细胞内自噬小体数量增多,Beclin-1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加,P62 表达减少;且 p-AKT/AKT 及 p-IPI3K/PI3K 比值明显降低,加入自噬抑制剂氯喹后,HepG2迁移能力明显增强,细胞黏附能力也明显增加,肿瘤细胞N-cadherin,Vimentin和P62表达显著上调,而E-cadherin,Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显受到抑制。小鼠异种移植模型中,接种LV-shFOXK1组裸鼠的瘤体体积及重量均下降,组织E-cadherin、Beclin-1 及 LC3Ⅱ/LC3I 增加,N-cadherin、Vimentin 及 P62 表达减少。结论1.生物信息学预测:基于在线数据库及生物信息学分析发现FOXK1在肝癌组织的mRNA及蛋白表达明显高于其在正常肝脏组织或邻近癌旁组织的表达,FOXK1高表达是TCGA-LIHC患者预后不良的独立危险因素;FOXK1或可通过调节肝癌细胞的EMT与自噬影响肝癌的恶性行为;2.临床组织验证:FOXK1在肝癌组织显著高表达,FOXK1高表达患者总生存期及无瘤生存期明显缩短,FOXK1是影响肝癌患者预后独立的预测指标;3.体内体外分子生物学验证:FOXK1表达下调可抑制癌细胞株HepG2的EMT,从而减弱了肿瘤细胞的迁移侵袭;FOXK1敲低通过抑制PI3K/AKT信号通路来抑制自噬;且FOXK1抑制诱导的自噬可减弱HepG2细胞的EMT。