研究背景与目的人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tension homologue deleted from chromosome10, pten,又叫做mmac1或tep1)属于PTP (protein tyrosine phosphatases)基因家族,定位于人类染色体10q23.3,具有脂质磷酸酶和蛋白质磷酸酶双重活性,是迄今为止发现的唯一一个具有双重磷酸酶活性的抑癌蛋白。PTEN的脂质磷酸酶活性能够特异性地使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate, PIP3)的3位磷酸基团去磷酸化,拮抗磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol3-kinase, PI3K)的功能,从而抑制P13K下游Akt信号通路的转导,从而产生抑制细胞生长、增殖和迁移等生物学行为的效应。目前已知,PTEN蛋白是继p53之后发现的与肿瘤关系最为密切的抑癌蛋白之一,在泌尿系统肿瘤和生殖系统肿瘤等诸多恶性肿瘤中均可检测至pten基因的突变或缺失。近来的研究发现细胞内PTEN总蛋白量的减少亦与肿瘤的发生密切相关。PTEN的研究已经成为生命科学和医学领域的一个热点方向,PTEN的生理功能在人类多种肿瘤发生和发展中的重要性已经被越来越多的研究者证实和承认。现有报道表明,在多种人类肿瘤中能够检测到pten的启动子区被甲基化修饰使基因表达受到抑制；pten基因的转录亦会受到p53等众多上游分子的精细调节；在转录后水平,PTEN蛋白的表达受到非编码RNA miR-21及miR-19等的抑制；在翻译后水平,PTEN可被泛素化、磷酸化和乙酰化修饰,从而改变PTEN在细胞内的定位、蛋白的空间构象、蛋白稳定性和脂质磷酸酶活性等3(图2)。PTEN的功能如此重要,其生理活性和蛋白稳定性也会受到严格而精密的调控。已有研究报道在多种人类肿瘤中能够可检测到pten基因启动子被甲基化修饰,从而使基因沉默；在转录后水平,PTEN蛋白的表达受到非编码RNA miR-21及miR-19等的抑制；在翻译后水平,PTEN可被泛素化、磷酸化和乙酰化修饰,从而改变PTEN的细胞内定位、蛋白空间构象、蛋白稳定性和自身磷酸酶活性等。泛素化降解与去泛素化修饰的动态平衡在蛋白水平的精细调节中具有重要地位。泛素连接酶(ubiquitin ligase, E3)与去泛素化酶(deubiquitinase, DUB)的功能相互拮抗,共同维持蛋白质的稳态。迄今为止,已发现的能够促进PTEN泛素化的E3共有5个分子,分别为Nedd4-1、WWP2、CHIP (C terminus of Hsc70-interacting protein)、XIAP和TRIM27/RFP,而具有促进PTEN去泛素化修饰功能的DUB只有HAUSP和USP13被发现。其中HAUSP只能够特异性地去除PTEN的单泛素化修饰,进而改变PTEN蛋白的细胞内定位,但并不会对PTEN蛋白的稳定性和蛋白的总量产生影响。因此,能够特异性去除PTEN蛋白的多聚泛素化修饰、抑制PTEN蛋白降解的DUB就只有USP13被发现,新的能够维持PTEN蛋白稳定性的DUB分子还有待于进一步的发掘与研究。FoxO (Forkhead box O)转录因子是细胞生命活动的重要调控分子,在细胞的多项生命活动中发挥着重要作用。FoxO蛋白与人类多种肿瘤相关。Akt是FoxO蛋白重要的上游调控分子之一。活化的Akt能够直接使FoxO家族蛋白磷酸化,促进其降解,抑制其下游靶基因的转录,从而影响细胞周期和细胞凋亡。PTEN作为PI3K/Akt信号通路负向调控的核心分子,其蛋白水平对于FoxO家族分子的功能发挥具有重要意义。本研究针对这一问题,鉴定了对PTEN蛋白水平具有正向调节作用的DUB,研究其在维持PTEN蛋白稳定中所发挥的作用及产生上述效应的分子机制；明确泛素连接酶CHIP对PTEN及其下游凋亡通路的影响。研究方法人源DUB家族根据蛋白的结构和组成特点可分为5个亚家族,分别是UCH、 USP、OTU、Josephin和JAMM/MPN+家族。我们围绕PTEN的DUB鉴定这一科学问题,从人源DUB家族全部成员中通过无偏性筛选,分别用等量的DUB过表达载体转染HCT116细胞,Western blot检测细胞内源PTEN水平,筛选出能够稳定PTEN蛋白水平的去泛素化酶分子OTUD3(OTU domain-containing protein3)。免疫共沉淀实验检测OTUD3与PTEN的相互作用,并确定相互作用区域。过表达OTUD3,检测细胞内Akt通路的活性。构建OTUD3敲低的MCF7细胞稳定株,检测OTUD3对细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。免疫组化检测结直肠癌组织样本、Western blot检测乳腺癌组织样本中OTUD3与PTEN的蛋白水平。通过DNA测序筛查乳腺癌组织中OTUD3与PTEN的天然突变体,并构建相应的过表达载体,检测这些突变对PTEN蛋白半衰期的影响。在乳腺癌MCF7细胞和乳腺上皮细胞MCF10A细胞中分别过表达PTEN特异性泛素连接酶CHIP,检测细胞内Akt通路的活性、FoxO家族蛋白的活性、Bim的分子水平以及对凋亡的影响。免疫组化检测乳腺癌组织中CHIP与Bim的表达水平。结果1.OTU亚家族中的成员OTUD3在过表达的情况下可以特异性上调PTEN蛋白水平,而OTU亚家族的其他成员分子没有上调PTEN蛋白水平的功能,表明OTUD3对PTEN的调节具有特异性。通过RNAi技术敲低内源OTUD3可引起PTEN蛋白水平的显著下降,且这一现象在多种细胞系中可稳定重复。但在细胞内过表达OTUD3丧失去泛素化酶活性的突变体OTUD3C76A不但不能使PTEN水平上升,反而使细胞内源PTEN的蛋白水平显著下降,出现十分明显的显性“负”效应。表明细胞内源OTUD3蛋白对PTEN的调节作用在PTEN的稳定性维持上具有重要地位,且OTUD3的这一功能依赖于其去泛素化酶活性。2. OTUD3能够直接与PTEN发生相互作用,介导二者相互作用的区域分别为OTUD3的OTU结构域与PTEN的C2结构域,且相互作用不依赖于OTUD3的去泛素化酶活性。本课题汇总了既往文献中报道的肿瘤组织中PTEN C2结构域的突变,分别为PTEN△M199、PTENP246L、PTEN△T319、PTENF341V、 PTENV343E、PTENL345Q、PTENT3481、PTEN1-319和PTEN1-342.在这些PTEN突变蛋白中,PTEN△M199、PTENF341V和PTEN1-319能够使PTEN丧失与OTUD3的结合能力,从而使PTEN蛋白稳定性降低,半衰期缩短,蛋白水平下降。3.细胞和分子水平的测试表明,OTUD3敲低所产生的分子效应与细胞学效应与PTEN敲低所产生的效应极为相似,均可导致Akt通路的过度激活,使细胞的增殖加快、侵袭能力增强、对顺铂诱导的细胞凋亡敏感性降低。OTUD3敲低对肿瘤细胞侵袭能力的影响尤其显著,在裸鼠成瘤实验中,OTUD3敲低细胞与PTEN敲低细胞均可在裸鼠体内发生肝脏转移,且二者严重程度相仿,使得裸鼠在皮下注射细胞后四周内即发生死亡,裸鼠成瘤实验无法完成。这一发现表明OTUD3在抑制肿瘤细胞的远处转移中扮演着重要角色。OTUD3的水平下降或缺失能够显著促进肿瘤的远处转移。4. OTUD3与PTEN在人类结直肠癌组织当中亦呈明显的正相关,且二者在肿瘤组织中的定位存在一致性。5.我们在乳腺癌组织中发现了OTUD3的两个突变蛋白,分别为OTUD3R79T和OTUD3E86K,在乳腺癌细胞系MCF7中分别梯度过表达OTUD3野生型、OTUD3R79T和OTUD3E86K突变蛋白,发现过表达OTUD3R79T能够使PTEN蛋白水平上调,与梯度过表达野生型OTUD3对PTEN的调控效应相似；而梯度过表达OTUD3E86K却得到与过表达野生型OTUD3相反的效应,细胞内源PTEN水平随着OTUD3E86K表达量的增加而显著下降。这一现象提示OTUD3R79T依然具有维持PTEN蛋白稳定性的功能,该突变并没有影响OTUD3分子的去泛素化酶活性,而OTUD3E86K则与OTUD3酶活突变体OTUD3C76A类似,过表达会出现“显性负”效应,成为PTEN水平的负向调控分子,提示这一位点氨基酸的突变可能影响到了OTUD3的去泛素化酶活性。过表达OTUD3R79T能够显著延长PTEN半衰期,而过表达OTUD3E86K使PTEN半衰期显著缩短。这一结果再次验证了OTUD3R79T对PTEN蛋白稳定性依然具有维持作用,但OTUD3E86K失去了正常功能,成为了PTEN水平的负向调控分子。OTUD3R79T和OTUD3E86K均可与细胞内源PTEN发生相互作用,且作用强度与野生型OTUD3类似,证明OTUD3R79T和OTUD3E86K之间的功能差异和其与PTEN的相互作用无关而可能与其去泛素化酶活性的下降或丧失有关。6.我们在50例乳腺癌样本及相应的癌旁组织中筛查PTEN突变,发现了PTEN3个种PTEN蛋白的突变体。其中PTENF341V失去与OTUD3结合的能力,其蛋白稳定性不能被OTUD3调控,蛋白半衰期缩短；而PTEN1224M和PTENE307K突变蛋白首次被发现,二者均能与OTUD3发生相互作用,且结合能力与野生型PTEN无明显差异。OTUD3能够维持二者的蛋白稳定性,过表达OTUD3能够使二者的半衰期显著延长。上述结果表明PTEN氨基酸序列的1224和E307位点不参与介导PTEN与OTUD3的结合和OTUD3对PTEN的稳定性维持。7.我们的研究证明了CHIP通过促进PTEN的泛素-蛋白酶体途径降解使细胞内PTEN蛋白水平下降,PI3K-Akt被过度激活,高度活化的Akt促进了下游FoxO家族分子的磷酸化。被磷酸化修饰的FoxO家族分子活性受到抑制,降解增加。其中的FoxO3分子作为多个基因转录调控的重要分子,被过度磷酸化修饰后与bim基因启动子及pten基因的启动子区域结合能力均下降,使得bim和pten基因的转录受到抑制,从而导致Bim蛋白和PTEN蛋白的合成减少。其中Bim蛋白水平的下降能够使细胞凋亡受到抑制,细胞产生凋亡抑制现象,即细胞对化疗药物诱导的细胞凋亡敏感性降低。而PTEN蛋白合成减少会进一步使PTEN蛋白水平下降,从而致使细胞内Akt的磷酸化水平进一步升高,FoxO3分子磷酸化比例进一步增加,pten基因转录受到更严重的抑制,从而形成了一个使PTEN蛋白水平不断下降的正反馈环路。即CHIP通过在转录水平和翻译后修饰水平对PTEN进行双重机制的调节,这两种调节机制使得细胞内PTEN水平不断下降,而这一正反馈的形成最终致使乳腺癌细胞MCF7和乳腺上皮细胞MCF10A对化疗药物诱导的细胞凋亡的敏感性均显著下降。对肿瘤组织的检测亦证实在乳腺癌组织中确实存在CHIP高表达的现象,且组织中CHIP的表达水平与PTEN和Bim的表达水平成反比。结论1.OTUD3是PTEN的去泛素化酶,能够维持PTEN蛋白的稳定性。2.OTUD3通过对PTEN稳定性的调控发挥其抑癌功能。3.乳腺癌组织中存在影响OTUD3功能的基因突变。4.泛素连接酶CHIP通过形成负向调节PTEN的正反馈环路抑制细胞凋亡。意义本课题首次鉴定了OTUD3是具有稳定PTEN蛋白功能的去泛素化酶,亦发现了OTUD3分子的首个底物蛋白PTEN。研究结果揭示了抑癌蛋白PTEN分子稳定性维持的重要机制,发现了在乳腺癌和乳腺上皮细胞中CHIP对PTEN转录水平和翻译后修饰水平的双重负向调节,为抑癌"Continuum Model"提供新的科学支持,也为肿瘤的靶向治疗提供了新的药物靶点。