适冷LeuDH表达与酶学性质及发酵优化的研究

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近年来,特殊功能基因的挖掘与开发是极端环境微生物领域研究热点。南极独特的极端地理环境,造就了低温和高盐的海冰环境,而生存于其中的微生物必然形成了独特的生理和生化代谢特征。南极来源适冷酶的特殊酶学特性和分子结构,使其在低温下可能具有较高催化效率,可降低催化反应活化能,对底物和产物有强特异性,可节约能源,具有广泛的应用前景,受到国内外学者的广泛关注。亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase,LeuDH)是一种特殊适冷酶,在酶促不对称合成L-叔亮氨酸中应用广泛。因此,本论文以南极海冰细菌为材料,对其体内leudh基因的克隆、表达和酶学特性,以及重组LeuDH菌发酵工艺进行系统研究,以期获得具有自主知识产权的抗逆基因资源,同时也为南极微生物适冷酶的开发与利用提供了理论依据。本论文利用分子生物学手段,从南极海冰微生物Pseudoalteromonas sp.ANT178中PCR扩增出leudh基因全长序列,命名psleudh。利用生物信息学对PsLeuDH分析,结果表明该基因大小为1 209 bp,可编码402 aa的蛋白质,理论等电点pI为5.08。经多重序列比对分析可知,PsLeuDH具有一个保守Phe结合位点,一个含有β折叠-α螺旋-β折叠构象的NAD+辅酶结合结构域,PsLeuDH属于Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶家族的成员。将psleudh基因与质粒pET-28a(+)连接,并将其转入E.coli BL21中,筛选阳性重组菌,并通过低温诱导培养的方法诱导目的基因的异源表达。利用Ni-NTA纯化重组蛋白(rPsLeuDH),并经SDS-PAGE进行蛋白纯度验证。结果表明纯化rPsLeuDH比活性为275.13 U/mg,回收率为24.73%。在纯化基础上,系统研究rPsLeuDH酶学特性:酶最适温度为30℃,且在0℃下保持40%酶活性,最适pH为9.0;当盐浓度为2.0 M时,rPsLeuDH的相对活性最高。底物特异性和动力学研究表明,L-leucine是rPsLeuDH的最适底物,通过在低温下保持较高kcat来保证低温下的催化活性。利用同源建模分析手段,与同源高温酶相比,适冷rPsLeuDH在结构上甘氨酸数量残基较多,精氨酸和脯氨酸残基的含量相对较低,并且盐桥数量较少,这些结构特征赋于蛋白分子高柔性以及较低的热稳定性,使其在低温下具有较高的活性。利用Plackett-Burman(PB)和Central Composte Design(CCD)实验设计对rPsLeuDH重组菌的发酵条件进行优化,筛选出NaCl、L-leucine的浓度和诱导温度是影响rPsLeuDH产量的关键因素,模拟出产rPsLeuDH的二次多元回归模型,确定了最优的发酵条件。通过进一步验证实验发现,产rPsLeuDH蛋白量模型有较好拟合性,其最优酶产量为75.90 U/mg,SDS-PAGE电泳验证其表达量显著增加。本研究建立的发酵培养模型,使产r PsLeuDH量比优化前提高了2.61倍,将为该重组蛋白大规模发酵生产提供重要参数。
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