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研究背景神经营养因子是维持神经元存活与正常生理功能的重要蛋白因子,在1952年由意大利神经科学家Rita Levi-Montaicini博士首先发现了神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）。目前神经营养因子家族主要包括神经生长因子（NGF）,脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）,神经营养因子-3（Neurotrophin-3,NT-3）及神经营养因子-4（Neurotrophin-4,NT-4）。其主要通过与对应的高亲和酪氨酸激酶受体结合并激活下游信号通路,起到维持神经元存活与促进神经生长的生理作用。神经营养因子对支持神经系统发育、成熟、维持生理功能及损伤后修复均有重要作用,但在神经发育、神经退行性疾病及神经损伤后修复中参与调控神经营养因子的分子及作用机制尚不明确。在临床治疗中对神经营养因子的应用有限,有待进一步开发。因此,深入研究神经营养因子在生理条件下的分子机制及神经疾病的病理过程,对进一步发掘神经营养因子的临床应用有重要意义,也为研究神经疾病的发生发展过程提供新思路。实验目的1.探讨三叉神经眼支发育中1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine 1-phosphate,S1P）调控NGF信号通路并影响神经元分化与神经纤维生长的作用机制;2.探讨在阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）中BDNF减少引起Tau蛋白与BDNF受体TrkB（Tropomyosin receptor kinase B）结合,并导致AD样病理改变的病理分子机制。实验方法1.S1P对三叉神经眼支神经纤维发育的影响。在三叉神经眼支发育模型中,通过组织免疫荧光染色观察不同胚胎日龄S1P转运体（Spns2）基因突变大鼠角膜神经纤维生长分布情况。2.S1P调节NGF及其受体（Tropomyosin receptor kinase A,TrkA）信号通路,影响三叉神经节发育的调控机制。对Spns2基因突变大鼠三叉神经节进行免疫荧光染色观察神经节细胞Trk受体表达情况。在体外实验中给与神经元S1P或NGF处理进行挽救,观察神经生长变化。通过siRNA敲减S1P受体s1pr3基因、进行活细胞成像研究S1P-S1PR3信号通路对TrkA表达及NGF-TrkA信号通路的影响。3.BDNF剥夺后激活天冬酰胺内肽酶（Asparagine endopeptidase,AEP）剪切Tau蛋白并阻滞TrkB信号通路的作用机制。使用Tau蛋白基因突变小鼠P301S、AD模型鼠3xTg和AD病人的脑组织蛋白样本检测AEP活性,Tau剪切蛋白Tau N368表达水平及Tau N368与TrkB结合的情况。体外培养HEK293细胞、SH-SY5Y细胞转染TrkB受体与Tau N368蛋白,用GST-pull down,免疫共沉淀、免疫荧光染色检测TrkB-Tau N368的结合及对TrkB信号通路的影响。建立原代神经元BDNF体外剥夺模型,观察TrkB与Tau N368相互作用及神经元AD样病理变化。4.BDNF体内剥夺模型的建立及挽救。采用BDNF2lox小鼠海马区注射Cre病毒建立BDNF敲除模型,并采用两种干预手段:1,Cre病毒注射一周后按10 mg/kg,5天/次的剂量小鼠腹腔注射TrkB与Tau结合位点的R1结构域重组多肽;2,同时注射Cre病毒与不可被AEP剪切的突变Tau蛋白病毒,AAV-Tau N255AN368A。从形态学、分子生物学、电生理及动物行为学多个维度观察AD样病理改变的情况:采用免疫荧光染色、Western Blot,免疫共沉淀等观察BDNF剥夺后TrkB与Tau N368的结合情况,TrkB下游信号改变及AD相关病理改变;通过Golgi染色,电镜观察神经元突触结构及树突棘形态改变;通过电生理检测观察神经元的功能学改变;通过水迷宫实验,恐惧记忆实验及新物体识别实验观察小鼠学习记忆的改变。实验结果及讨论1.Spns2突变导致三叉神经纤维长入角膜过程延迟,髓鞘结构形成不良。胚胎E22.5 Spns2ins/ins大鼠角膜基质层神经纤维密度明显下降,角膜正常结构破坏。在髓鞘发育中,Spns2ins/ins大鼠神经纤维发育过程较WT偏慢,且能看到多种髓鞘异常的形态。从E 16.5天至E 18.5天,Spns2ins/ins大鼠三叉神经纤维长入角膜的速度明显慢于WT。以上结果表明Spns2突变导致S1P胞外浓度下降使三叉神经眼支纤维在发育过程中生长延迟。2.Spns2基因突变大鼠三叉神经节细胞NGF受体TrkA表达下降,TrkA及下游信号分子磷酸化水平下降。在原代神经节细胞的培养液中补充S1P可挽救Spns2突变导致的神经纤维生长缓慢。siRNA敲减WT的S1P受体s1pr3基因可导致神经纤维生长缓慢,再补充NGF或S1P均不能挽救异常表型。以上结果提示S1P-S1PR3信号通路在NGF-TrkA信号通路上游,并通过调节TrkA表达与磷酸化水平调控三叉神经纤维的发育。3.AD转基因小鼠及AD病人随年龄增长BDNF逐渐减少,Akt磷酸化水平下降,导致AEP激活,剪切产生Tau N368,该剪切体可与TrkB结合,进一步抑制TrkB下游信号通路,使神经元退变、凋亡,诱发AD样病理改变。该实验证明BDNF减少引发Tau N368与TrkB结合是导致神经元AD样病理改变的关键因素。4.在前期体外实验基础上,建立体内BDNF剥夺模型,即BDNF2lox小鼠海马区Cre病毒注射使BDNF敲除,使AEP激活,Tau N368表达水平升高,Tau N368与TrkB结合。通过腹腔注射TAT-R1-FITC多肽干扰Tau N368与TrkB结合,或通过高表达AEP不可剪切的突变型Tau N255A/N368A蛋白抑制Tau N368产生两种干预,均可以挽救BDNF剥夺造成的神经元AD样病理改变。以上实验在体内模型中证明了BDNF剥夺是导致AD发生发展的重要因素。