论文部分内容阅读
目的：构建野生型及双位点突变型E1A介导的溶瘤腺病毒，研究上述病毒E1A、mE1A基因对p21CIP1/WAF1的调控及其抗肿瘤作用。 方法：1.构建穿梭质粒pDC315-E1A:以pXC1质粒（实验室保存）为模板，设计引物，分别引入酶切位点EcoRI和SalI，PCR扩增得到E1A的cDNA，双酶切并纯化PCR产物，克隆进质粒pDC315（实验室保存），构建pDC315-E1A，酶切鉴定并测序。2.构建穿梭质粒pDC315-mE1A:以pDC315-E1A为模板，混合PCR，获得双位点缺失的mE1A的cDNA，EcoRI和SalI酶切、纯化后，克隆至质粒pDC315中，酶切鉴定并测序。同时构建对照质粒pDC315-EGFP，方法同上。3.溶瘤腺病毒的重组、包装和鉴定:质粒pDC315、pDC315-E1A、pDC315-mE1A以及pDC315-EGFP，分别与骨架质粒pBHGE3共转染HEK293细胞，9-14天后出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，提取病毒总DNA并应用PCR鉴定，鉴定正确的腺病毒分别命名为Ad5-DC315、Ad5-DC315-E1A、Ad5-DC315-mE1A以及Ad5-DC315-EGFP。4.四种病毒大量扩增后测定滴度，分别感染Hela细胞、Ketr-3细胞及正常细胞HK-2，Western Blot检测腺病毒E1A蛋白在各细胞中的表达情况，及其对细胞周期依赖激酶抑制因子p53、p21的影响，CCK-8法检测腺病毒对细胞增殖的影响，结晶紫染色法检测溶瘤腺病毒的细胞毒性作用。 结果1.质粒pDC315-E1A、pDC315-mE1A以及pDC315-EGFP经酶切鉴定和测序表明构建成功。2.PCR鉴定表明病毒Ad5-DC315-E1A、Ad5-DC315-mE1A以及Ad5-DC315-EGFP包含目的基因。3.四组病毒分别感染Hela细胞、Ketr-3细胞及正常细胞HK-2后，Western Blot检测发现在这三种细胞均能检测到E1A、mE1A蛋白的表达，并且E1A能上调p53、p21的表达，而mE1A对两者的表达水平没有明显影响。4.CCK-8法、结晶紫染色法显示四种病毒对Hela细胞、Ketr-3细胞均有杀伤及增殖抑制作用，其中仅Ad5-DC315-E1A对正常细胞HK-2存在杀伤、抑制增殖作用。CCK-8实验结果显示病毒对细胞增殖的抑制作用与病毒的浓度及感染时间存在正相关性，其中Ad5-DC315-E1A组对肿瘤细胞的杀伤作用、增殖抑制作用最强，P＜0.05，差异有统计学意义;其他三组与空白对照相比，对肿瘤的抑制作用无明显差异，P＞0.05。 结论成功构建了条件增殖型腺病毒Ad5-DC315-E1A、Ad5-DC315-mE1A以及Ad5-DC315-EGFP，证实了E1A基因在肿瘤胞中的抑癌作用，其能够上调细胞周期蛋白激酶抑制因子p53、p21的表达，但改造的mE1A失去了野生型E1A的抑癌功能，其介导的溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的特异性抑制作用不明显，有待进一步研究与探索。