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背景子宫腺肌病是子宫内膜及间质异位种植于子宫肌层引起的疾病。发病机制尚不清楚。越来越多的研究表明子宫内膜腺上皮细胞的上皮间质转化过程参与到子宫腺肌病的发病中。上皮间质转化过程能赋予子宫内膜腺上皮细胞侵袭及迁移能力,具有侵袭及迁移能力的子宫内膜腺上皮细胞是子宫腺肌病发病的先决条件。上皮间质转化能够被细胞外囊泡诱导。细胞外囊泡是一种细胞与细胞间新的通讯方式,所有的真核细胞均分泌细胞外囊泡。有研究已经从人子宫、人子宫上皮细胞和人子宫内膜异位基质细胞中分离出细胞外囊泡。细胞外囊泡在介导细胞-细胞通讯中起重要作用,并参与包括癌症在内的一系列疾病的发病机制。细胞衍生的囊泡被认为有助于体内平衡,疾病发展和进展。具有侵袭能力的供体细胞产生的囊泡可以传递内容引起受体细胞获得侵袭能力。已经有研究证实从不同细胞模型中分离的细胞外囊泡能够诱导受体细胞上皮间质转化。本研究发现子宫腺肌病组织中能分离出子宫腺肌病源性细胞外囊泡(AMEVs),在体外通过共培养方式,子宫腺肌病源性细胞外囊泡可诱导子宫内膜腺上皮细胞上皮-间质转化。子宫腺肌病组织来源的细胞外囊泡可能通过携带的内容物,引起子宫内膜腺上皮细胞HSPB1及ZEB1表达增加,诱导子宫内膜腺上皮细胞上皮-间质转化。目的1.明确子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡的结构特征及内含蛋白质特点2.验证子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡诱导子宫内膜腺上皮细胞上皮间质转化3.分析子宫腺肌病组织来源细胞外囊诱导进子宫内膜腺上皮细胞上皮间质转化的机制方法1.获得重庆医科大学伦理委员会批准和患者本人同意后,收集临床须切除子宫的,诊断为子宫腺肌病的18例患者的子宫腺肌病病灶组织,及临床须切除子宫的,诊断为子宫肌瘤的10例患者的子宫内膜组织。2.将临床收集的子宫腺肌病病灶组织,通过磨碎和匀浆,然后通过差速离心法及密度梯度离心法分离提纯子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡,透射电镜及低真空扫描电镜观察子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡的形态,Western Blot鉴定其表面标志分子CD9、CD63及Flotillin-2,粒度仪及纳米粒子追踪仪分析子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡的粒度分布,高效液相色谱-质谱联用分析子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡的蛋白质内容物。3.通过挖掘数据库及文献以及蛋白功能组学分析子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡蛋白质内容物中,与上皮间质转化相关的蛋白质,以及其下游通路。4.将临床收集的子宫内膜组织,通过研磨,匀浆,双重滤网过滤,上皮细胞贴壁时间差分离纯化子宫内膜腺上皮细胞。并通过EECs细胞株与子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡共培养,CCK-8检测子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡对EECs的增殖力影响,激光共聚焦显微镜观察EECs摄取子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡的过程。并通过Western Blot检测共培养后,CK 19、E-cadherin及Vimentin的变化,并进一步用免疫组化检测共培养72h后EECs爬片中CK 19、E-cadherin、Vimentin、HSPB1及ZEB1的变化。并进一步用流式细胞仪检测细胞松弛素D阻断EECs摄取子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡,以及阻断后HSPB1的变化。结果1.采用100000×g离心力从子宫腺肌病组织中分离出子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡,其平均粒径221.0±8.3 nm的类圆形双层膜囊泡,囊泡表面表达CD9、CD63及Flotillin-2,内含2579种不同蛋白质。2.通过蛋白质功能组学分析方法及文献搜索,发现20个与上皮间质转化相关的蛋白质,包括:HSPB1、ANXA2、MSN、EZR、CTBP1、CTBP2、HSPA5、CCAR2、S100A4、RTN4、TRIM28、GSK3B、BMP7、ENG、CTNNB1、DDX17、PPP3R1、PDCD4、PEF1、PDCD6。其中HSPB的指数修饰的蛋白质丰度指数(emPAI)为44.96,含量最高。ANXA2的emPAI为23.25。HSPA5和MSN的emPAI>5,S100A4和EZR的emPAI≥1,其余14种蛋白具有emPAI<1:CTBP1,CTNNB1,PDCD6,PPP3R1,PEF1,CTBP2,TRIM28,RTN4,DDX17,CCAR2,GSK3B,PDCD4,BMP7和ENG。3.子宫内膜腺上皮细胞能够摄取子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡,并且这一摄取过程能够被细胞松弛素D部分阻断。子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡能显著增加子宫内膜腺上皮细胞的增殖率(P<0.001)及存活率(P<0.001)。子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡与子宫内膜腺上皮细胞共培养24h后,子宫内膜腺上皮细胞内囊泡荧光量增加明显。当培养72h后,子宫内膜腺上皮细胞内囊泡荧光量逐渐减弱。4.子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡与子宫内膜腺上皮细胞共培养72h后,子宫内膜腺上皮细胞的侵袭能力明显高于对照组(P<0.001)。与对照组比较,细胞内CK19和E-cadherin表达显著降低,Vimentin显著升高(P均<0.05)。与子宫腺肌病组织高表达Vimentin,低表达CK19和E-cadherin一致(P均<0.05)。5.子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡与子宫内膜腺上皮细胞共培养72h后,与对照组比较,细胞内HSPB1及ZEB1均显著升高(P均<0.05)。与子宫腺肌病组织高表达HSPB1的一致。与对照组及无阻断组比较,细胞松弛素D能够显著减缓HSPB1的升高水平(P均<0.05)。子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡与子宫内膜腺上皮细胞共培养前后,E-cadherin的下降水平与HSPB1呈显著负相关关系(R=0.894,P=0.001),E-cadherin的下降水平与ZEB1亦呈显著负相关关系(R=0.762,P=0.01)。结论1.子宫腺肌病组织能分泌细胞外囊泡,平均粒径221.0±8.3 nm,为圆形或类圆形脂质双分子层膜囊泡,囊泡表达CD9、CD63及Flotillin-2膜蛋白。囊泡内含有2579个蛋白,其中含20个与上皮-间质转化相关蛋白。2.子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡增加子宫内膜腺上皮细胞增殖率和存活率,在体外,子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡促进子宫内膜腺上皮细胞侵袭,诱导子宫内膜腺上皮细胞上皮间质转化。3.子宫腺肌病组织来源细胞外囊泡通过传递内容物引起子宫内膜腺上皮细胞上皮-间质转化。结合蛋白质功能分析,子宫内膜腺上皮细胞上皮-间质转化可能与共培养后HSPB1及ZEB1的升高相关。