肝癌为我国常见恶性肿瘤之一，我国每年约有ll万人死于肝癌，且发病率有上升趋势。肝癌患者的生存时间一般低于6个月，目前临床较为有效的治疗方法有手术切除、肝移植、栓塞化疗、无水酒精注射、低温消融等，这些治疗措施仅对小肝癌有较好的治疗效果，对远处转移的微小病灶其疗效尚不能令人满意。近年来，肿瘤的免疫治疗成为肿瘤研究的新热点。由于肿瘤患者机体免疫功能存在严重障碍，特别是树突状细胞(DC)存在数量和功能上的缺陷，无法诱导初次免疫应答和激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应，使机体无法对肿瘤抗原产生再次免疫应答。为了增强机体的免疫应答，有研究者将肿瘤患者自身的DC进行体外培养，并将肿瘤抗原导入DC，结果发现这种方法可以激发机体对肿瘤细胞的免疫应答，此即为以DC为基础的肿瘤疫苗(简称DC瘤苗)。 近年来，DC瘤苗在实验性肝癌免疫治疗中取得了良好效果，Lee等应用肝癌细胞株Hepa1-6裂解物致敏的DC治疗实验性小鼠肝癌，结果58.3％的小鼠肿瘤消失，对于大的肝癌也能使肿瘤缩小。然而目前的DC瘤苗在肝癌治疗方面存在诸多不足：(1)肝癌细胞的抗原性较弱，缺乏特异性抗原。研究发现只有使用典型肿瘤抗原多肽的抗原决定簇致敏DC才能诱导出抗肿瘤反应，目前可以确定的肿瘤特异性抗原与肿瘤相关抗原有限，单一抗原的免疫攻击尚不足以有效地杀灭体内的肿瘤细胞，迄今人们尚未找到肝癌特异性抗原，因此，对于肝癌的免疫治疗首要问题是寻找和选择理想的肝癌特异性抗原或相关抗原；(2)DC瘤茁在诱导抗肿瘤效应的同时也诱发了严重的自身免疫性疾病。有研究发现甲胎蛋白(AFP)可作为肿瘤相关抗原应用于肝癌免疫治疗，然而针对AFP的细胞免疫并不能有效治疗HBV相关性肝癌。在我国，肝癌的发生与HBV感染密切相关，相关研究已经发现肝癌患者血清HBsAg检出率高达90％以上，提示HBsAg是肝癌的重要相关抗原之一。以HBsAg作为肝癌相关抗原构建DC瘤苗进行免疫治疗可能是一个合理的选择。目前HBsAg—DC瘤苗对肝癌的免疫治疗作用研究不多，有关HBV抗原基因修饰DC瘤苗不同途径对肝癌的免疫治疗更未见报道。鉴此，本研究以整合HBV基因组的HepG222.1.5为细胞模型，通过携带有编码HBsAg基因的重组腺病毒载体的介导，探讨不同免疫途径腺病毒介导的HBs抗原基因修饰的DC瘤苗对肝癌动物模型的免疫治疗效果，以期为HBV抗原基因修饰DC瘤苗治疗肝癌提供实验依据。 材料与方法： 1.小鼠DC的诱导培养和鉴定[43]：参考Inaba等技术并稍作改进，采集小鼠骨髓细胞，通过在细胞因子GM—CSF、IL-4和TNF—a刺激下，诱导培养出成熟的Dc细胞；采用流式细胞仪分析DC特异性表面分子的表达；采用MTT法进行同种异体的混合淋巴细胞反应试验(MLR)； 2.HBsAg基因修饰的DC(HBsAg—DC)瘤苗构建[39]：采用重组腺病毒介导HBsAg基因修饰树突状细胞，构建携带HBsAg基因的DC瘤苗； 3.肝癌动物模型的建立[68]：取对数生长期的HepG222.1.5肝癌细胞接种于C57BL/6J小鼠腿部皮下，建立荷瘤小鼠模型； 4.HBsAg—DC瘤苗对实验性肝癌的治疗：采用皮下注射、静脉注射和瘤体注射三种途径回输HBsAg—DC瘤苗，比较不同治疗途径HBsAg—DC瘤苗对荷瘤C57BL/6J小鼠免疫治疗作用； 5.HBsAg—DC瘤苗对实验性肝癌的免疫保护性作用：选择研究(4)所得的最佳免疫治疗途径，给予C57BL/6J小鼠注射HBsAg—DC瘤苗2次，后接种对数生长期的HepG222.1.5肝癌细胞(未转染DC瘤苗和PBS做对照)，用乳酸脱氢酶释放法测定免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性，探讨HBsAg—DC瘤苗保护性免疫反应。 统计学处理 使用spss12.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均值士标准差((-x)±s)表示，资料采用方差统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。 结果 1.DC的培养及鉴定 1.1在倒置显微镜下观察，培养初可见有较多粘附圆形细胞，随着时间推移，胞体出现树突状突起，继而呈集落样生长，成熟后Dc细胞体积明显增大且形态不规则，有多个不等的突起，呈现特征性的星状、树突状树突样的突起。培养过程所见符合DC形态学改变。 1.2采用免疫荧光对培养12d后所获的DC细胞进行标记，通过流式细胞仪分析，结果表明，贴壁的DC前体细胞，在体外经过细胞因子诱导后，高表达CD40(81.4％)、CD80(63.5％)、CD86(72.6％)、33D1(61.7％)，具有典型的DC细胞表型标志。 1.3为了观察DC刺激同种异体T细胞的增殖能力，我们采用MTT法进行同种异体的混合淋巴细胞反应试验(MLR)，结果显示，在DC：T比例为1：1、1：5、1：10、1：20时，DC组刺激指数(SI)分别为：11.2、7.7、6.2、5.1，对照组(MNC)刺激指数(SI)分别为：3.3、2.6、1.8、1.2， (P<0.05)，DC具有很强的刺激同种异体T细胞的增殖能力。 2.HBsAg基因修饰DC瘤苗(HBsAg—DC)的构建 重组腺病毒载体转染小鼠DC，通过倒置荧光显微镜下观察显示，Ad—HBsAg转染DC后48h，约90％以上DC表达示踪的绿色荧光蛋白(EGFP)。用ELISA检测转染DC中目的蛋白HBsAg的分泌，结果于感染后1～4天可检测出高水平的HBsAg并逐日增强，表明重组腺病毒已经有效介导HBsAg在DC中表达，成功构建出HBsAg—DC瘤苗。 3.HBsAg—DC瘤苗回输途径比较及对荷瘤小鼠的治疗效果 分别通过皮下、尾静脉、瘤体内注射HBsAg—DC瘤苗对荷瘤小鼠模型治疗，36天之内肿瘤大小变化分别为：(49.00±11.42)mm2、(61.08±6.56)mm2、(65.25±18.29)mm2，经方差统计分析，皮下、尾静脉、瘤体内注射三组之间比较有明显差异(F=3.4675，P<0.05)，皮下注射HBsAg—DE瘤苗明显优于瘤体内注射、尾静脉注射(P<0.05)。瘤体内注射组与尾静脉注射组比较无统计学差异(P>0.05)，提示最佳免疫治疗途径为皮下注射途径。 4.HBsAg—DC瘤苗皮下免疫治疗效果分析 采用皮下免疫治疗，HBsAg-DE组、未转染DC组、PBS组三组之间36天内肿瘤大小变化分别为：(49.00±11.42)mm2、(82.83±22.48)mm2、(108.83±31.64)mm2，经方差统计分析，HBsAg-DC组、未转染DC组、PBS组三组之间比较有明显差异(F=19.7944，P<0.01)，HBsAg-DE瘤苗组肿瘤的生长明显缓慢，未转染DC组次之，PBS组肿瘤的生长速度最快(P<0.05)，提示采用皮下注射HBsAg—DC瘤苗对实验性肝癌有一定的免疫治疗作用。 5.HBsAg-DC瘤苗免疫接种后对HepG222.1.5细胞攻击的免疫保护作用 HBsAg—DC瘤苗免疫接种后，小鼠肿瘤的生长受到明显抑制，瘤体出现延迟，同时生长减慢。接种后18 d时仍未长出肿瘤，而未转染DC、PBS对照组小鼠均于接种后7d内成瘤，HBsAg-DE组、未转染DC组、PBS组三组间36天内肿瘤大小变化分别为：(16.17±6.94)mm2、(62.50±17.40)mm2、(108.83±31.64)mm2，经方差统计分析，HBsAg—DC组、未转染DC组、PBS组三组之间比较有明显差异(F=57.1539，P<0.01)，HBsAg-DE组优于未转染DC组和PBS组(P<0.05)，未转染DC组优于PBS组(P