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研究背景脑外伤是神经系统疾病中最常见的损伤,对人类的生命有着严重的威胁,其致残率、患病率和死亡率居高不下,并且每年都有上升的趋势。我国人口基数大人口增长快,无论患病还是发病数量都是惊人。早前报道全球每年有近1000万人发生脑外伤,其中有580万人因脑外伤而死亡,占到世界死亡人口的10%,根据预测到2020年脑外伤将成为全球第三大类疾病。我国在研究脑外伤方面,主要侧重在临床方面,如脑外伤的救治、预后以及康复等方面,涉及到颅脑外伤的急救,各种治疗方式的优缺点,治疗后的认知功能障碍护理、后遗症等等,然而对脑外伤的内源性保护机制的研究相对较少。脑外伤引起的神经损伤主要为直接损伤和继发性的间接脑损伤,直接或间接引起的神经元的凋亡以及外伤后脑水肿引起的继发性损害。大脑是动物和人类的一个重要的组织器官,大脑皮层包括大量的神经元,是控制行动、语言、思维活动的重要区域。科学家在人类和动物的实验中发现,脑外伤后大脑皮层的损伤,可以引起严重的行为、语言、思维活动的损害,严重的影响了患者的病情和预后,目前尚缺乏有效的治疗和保护措施,尤其是内源性的保护机制。因此对脑外伤后大脑的保护机制以及措施的研究成为国际和国内近几年研究的热门话题。颅脑损伤后,遭受打击的神经细胞会释放以谷氨酸为主的兴奋型神经递质,激活谷氨酸受体并且直接或者间接的启动电压依赖性Ca2+通道,Ca2+的大量内流使细胞内Ca2+超载。Ca2+与钙离子调节蛋白相结合,进一步的反应作用而使得皮层神经元受到损害。另一方面,产生大量超氧阴离子产生,进一步反应生成过氧化亚硝酸盐离子或亚硝酸根离子,进而进一步抑制能量代谢。能量代谢的抑制使细胞内膜损伤和自由基增加,致使细胞内线粒体肿胀等多种因素引起细胞的凋亡。近年来我们在研究中发现在脑外伤脑损伤后释放大量谷氨酸的同时也释放着一种具有神经保护作用的肽类神经递质N-乙酰天冬氨酸谷氨酸(N-acetylaspartylglutamate,NAAG),NAAG对外伤后谷氨酸的释放具有极强的抑制作用。NAAG肽酶位于胶质细胞上,然而NAAG释放后很快被NAAG肽酶水解成N-乙酰天冬氨酸(N-acetylaspartate,NAA)及谷氨酸,因此而失去了神经保护作用。由此NAAG肽酶的活性被抑制,从而抑制NAAG的降解,提高突触间隙NAAG的浓度,进而减少谷氨酸释放在病理进程中的进一步损害。NAAG肽酶抑制剂在大量的试验中被成功合成并在谷氨酸过度释放的谷氨酸毒性模型中进一步证实了其保护作用,然抑制剂易受环境以及自身药物浓度等方面的影响而影响其发挥作用的稳定度,NAAG肽酶基因剔除后能更稳定的消除NAAG肽酶的表达从而起到神经保护作用,目前在基因层面的研究目前鲜为少见。在本试验中,应用控制性脑皮质撞击仪,对前期成功建立起来的GCPⅡ基因剔除模型小鼠进行打击制作中度颅脑损伤模型的研究,通过一系列检测指标,观察大脑皮层损伤以及继发性变化,从而进一步认证GCPⅡ基因剔除对小鼠脑外伤后脑组织的保护作用。第一部分小鼠GCPⅡ基因剔除对脑外伤后神经元的影响的研究目的通过对小鼠中度颅脑损伤模型的建立,对小鼠大脑损伤周围区神经元的凋亡情况进行研究,探讨GCPⅡ基因剔除对脑外伤后神经元的影响。方法雄性C57BL/6J小鼠随机20只,随机分成两组(C57BL/6J小鼠假手术组10只,C57BL/6J小鼠颅脑损伤组10只);雄性GCPⅡ基因剔除小鼠20只,随机分成两组(GCPⅡ基因剔除小鼠假手术10只,GCPⅡ基因剔除小鼠颅脑损伤组10只)(均为8-12W,体重20-25g,均由上海南方模式生物研究中心提供)。取0.6%戊巴比妥溶液,80mg/kg对小鼠行腹腔注射麻醉;将小鼠固定于脑立体定向仪(Stoeling Inc.USA);并在人字缝和矢状缝的交界处消毒。作正中切口,镊子分开头皮并用骨膜剥离子剥离骨膜;电钻在人字缝之间和右侧冠状缝、中线旁3mm处进行颅骨钻孔,做出直径为3mm的骨窗并暴露完整硬脑膜;应用Pin PointTMPCI3000精细颅骨撞击仪(Hatteras Instruments Inc.USA)设定打击参数(打击深度1.0mm;打击时间均为80ms;打击速度均为1.5m/s),以直径3mm的打击头行精确撞击小鼠脑皮质。还回骨瓣,头皮进行缝合。假手术组在麻醉后暴露骨窗,对脑皮质不打击,还纳骨瓣并缝合头皮。伤后24h对小鼠进行神经功能评分,断头、取脑、切片后行免疫荧光染色,通过对损伤周围区域凋亡神经元进行计数,观察不同组别神经元凋亡的变化。结果神经功能评分的结果表明,实验结果显示脑外伤后GCPⅡ基因剔除小鼠在神经功能综合评分方面相对C57BL/6J小鼠明显的改善和提高,外伤后GCPⅡ基因剔除小鼠与C57BL/6J小鼠神经功能评分差距有统计学意义(p<0.05),GCPⅡ基因剔除小鼠较C57BL/6J小鼠外伤后神经元凋亡数量明显减少,两组数值差距具有统计学意义(p<0.05)。结论通过研究我们发现小鼠GCPⅡ基因敲除后,脑组织损伤周围区域神经元凋亡细胞数目明显减少,小鼠神经功能明显改善。第二部分小鼠的GCPⅡ基因剔除对脑外伤后脑水肿的影响的研究目的研究普通小鼠和GCPⅡ基因剔除后小鼠脑外伤后脑水肿以及神经功能的变化,探讨并研究GCPⅡ基因剔除后对脑外伤后脑水肿的影响。方法雄性C57BL/6J小鼠随机20只,随机分成两组(C57BL/6J小鼠假手术组10只,C57BL/6J小鼠颅脑损伤组10只);雄性GCPⅡ基因剔除小鼠20只,随机分成两组(GCPⅡ基因剔除小鼠假手术10只,GCPⅡ基因剔除小鼠颅脑损伤组10只)(均为8-12W,体重20-25g,均由上海南方模式生物研究中心提供)。应用Pin PointTMPCI3000精细颅脑撞击仪,设定参数(打击深度为1.0mm;打击时间为80ms,打击的速度为1.5m/s),精确撞击小鼠脑皮质。小鼠颅脑外伤后24h,进行干湿重比较法测定脑组织含水量,MRI扫描并测量计算损伤区域水肿体积以及T2WI序列的信号强度,行大脑外伤周围区域免疫荧光染色,检测Western Blot检测AQP4蛋白的表达,检测血脑屏障破坏程度。结果GCPⅡ基因剔除小鼠较C57BL/6J小鼠外伤后神经功能明显善(p<0.05);GCPⅡ基因剔除小鼠脑组织含水量、水肿体积以及外伤区域T2WI信号强度较C57BL/6J小鼠组降低(p<0.05);GCPⅡ基因剔除小鼠明显减少损伤侧伊文思蓝含量(p<0.05);GCPⅡ基因剔除小鼠免疫荧光检测到脑组织损伤区域周围星形胶质细胞AQP4蛋白含量明显下降;Western Blot检测AQP4蛋白的表达明显下降(p<0.05)。结论小鼠的GCPⅡ基因剔除后脑外伤后脑水肿较C57BL/6J小鼠明显减轻,神经功能明显改善,进一步证明小鼠GCPⅡ基因敲除后对脑外伤后脑组织的保护作用。