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单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,Lm）是一种革兰氏阳性的食源性致病菌,可引起老年人、孕妇、婴幼儿和免疫功能缺陷患者的感染。根据细菌的菌体抗原和鞭毛抗原可以将Lm分为14种血清型,其中血清型4b、1/2b和1/2a的菌株引起大多数人类临床李斯特菌病。李斯特菌菌体抗原性是由特定糖基修饰的壁磷壁酸（Wall teichoic acids,WTAs）所赋予的。壁磷壁酸作为李斯特菌细胞壁上重要的表面糖聚合物,是细菌重要的毒力因子,在细菌对宿主细胞的黏附、侵袭和毒力等方面发挥重要作用。根据壁磷壁酸糖基化修饰的差异,将Lm壁磷壁酸分为两类,分别为鼠李糖基修饰的Ⅰ型WTAs和半乳糖基与葡萄糖基共同修饰的Ⅱ型WTAs。双糖基修饰的Ⅱ型W TAs在李斯特菌感染和致病中的作用机制有待深入阐明。本研究在构建NTSN1086和NTSN2723突变株和回复株的基础上,对其在李斯特菌菌体抗原特性、形态结构特征及抗胁迫特性进行了研究。此外,以肠上皮细胞、宫颈癌细胞和小鼠为研究对象,对其毒力进行了评价。双糖基修饰的Ⅱ型WTAs功能的解析,有利于揭示Lm感染和致病的分子作用机制,为李斯特菌的预防和控制提供新的认识。1.NTSN1086和NTSN2 723突变株的构建对NTSN1086和NTSN2723进行的生物信息学分析结果显示,这两个基因分别编码半乳糖基转移酶和葡萄糖基转移酶。与NCBI数据库中75个血清型4b李斯特菌的序列高度同源,为4b型菌株中的高度保守基因。其同源基因敲除后,导致WTAs分别缺失半乳糖基和葡萄糖基,说明NTSN1086和NTSN2723分别参与WTAs的半乳糖基和葡萄糖基修饰。双糖基共同修饰WTAs在李斯特菌感染和毒力中的作用有待深入阐明。本研究利用同源重组技术,成功构建半乳糖基缺失突变株NTSNΔ1086、回复株N TSNΔ1086::1086、葡萄糖基缺失株NTSNΔ2723和双糖基缺失株NTSNΔ1086Δ2723,为研究糖基化修饰WTAs对其功能发挥中的作用提供了生物材料。通过玻板凝集试验和激光共聚焦显微镜观察技术,对细菌的菌体抗原特性进行了测定。结果表明,NTS NΔ1086和NTSNΔ1086Δ2723与抗血清型4的抗体不能发生凝集反应,与荧光标记抗体结合能力减弱。而NTSNΔ2723缺失株与野生株均能与抗血清型4的抗体反应。由此提示,半乳糖基在WTAs菌体抗原特性中发挥主要作用,葡萄糖基发挥次要作用。2.NTSN-1086和NTSN2723的生物学特性研究为了研究WTAs糖基化修饰对细菌的形态结构和生长繁殖的影响,利用Native P AGE检测WTAs的构成成分,通过扫描电子显微镜对细胞形态进行观察。结果表明,NTSN1086和NTSN2723的缺失导致WTAs结构的变化,但对细菌在BHI培养基中的生长未造成明显影响,其中NTSN1086缺失株中部分细菌出现缢痕但不能分裂的现象。此外,本研究还对糖基化修饰WTAs在李斯特菌生物被膜形成能力以及对抗菌肽的抗性中的作用进行了研究。NTSN1086的缺失对李斯特菌生物被膜形成能力造成显著影响,对抗菌肽CRAMP和LL37的抗性显著下降。而NTSN2723的缺失对被膜的形成及对抗菌肽的抗性没有明显影响。由此提示,壁磷壁酸半乳糖基修饰在细菌的形态结构和抗胁迫能力中发挥重要作用。本研究还对细菌表面毒力因子与细胞壁的结合能力及其定位进行了检测。从免疫印迹结果中观察到,肌动蛋白聚集因子ActA、内化素蛋白InlA、含有GW基序的自溶素蛋白Ami和内化素蛋白InlB在细胞壁中的含量均显著降低,在细菌培养上清中的含量显著增加。另外,选取ActA单抗作为一抗,通过激光共聚焦显微镜观察,发现NTSN1086缺失菌株聚集肌动蛋白能力下降,不能形成肌动蛋白尾,进而不能进行胞间迁移。由此证明WTAs半乳糖基的缺失显著削弱了 InlA、InlB、Ami和ActA与细胞壁的结合能力。而NTSN2723的缺失对毒力蛋白的表面锚定能力没有影响。以含有InlB蛋白受体的Hela细胞系和含有InlA蛋白受体的Caco-2 BBe细胞系作为体外感染模型,对细菌黏附、侵袭和增殖能力进行了测定。NTSNΔ1086缺失株和双缺失株显著降低了对Hela细胞黏附、侵袭和增殖的能力。回复株NTSNΔ1086::1086的黏附、侵袭和增殖能力恢复到与野生株相似的水平。NTSNΔ2723缺失株黏附细菌的的能力与野生株没有差别,但侵袭增殖能力显著降低。双缺失株的黏附、侵袭和增殖能力显著低于NTSNΔ2723,侵袭能力显著低于NTSNΔ1086。从细菌黏附、侵袭和增殖Caco-2 BBe细胞系的结果中观察到,NTSN1086缺失株的侵袭能力和胞内增殖能力极其显著低于野生株,NTSN2723缺失株的胞内增殖能力显著降低,同时双缺失株的增殖能力显著低于NTSNΔ1086和NTSNΔ2723。由此表明壁磷壁酸半乳糖基和葡萄糖基在Lm黏附、侵袭和增殖过程中共同发挥作用,但半乳糖基比葡萄糖基的作用更显著。以小鼠作为口服感染模型,对NTSN1086和NTSN2723突变株在体内器官定植能力进行了测定。NTSNΔ1086在回肠、结肠、肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏中的定植能力显著下降。NTSNΔ2723的定植能力在肠系膜淋巴结和肝脏中显著下降。双缺失株在结肠中的定植能力显著低于NTSNΔ1086,在结肠、肝脏和粪便中显著低于NTSNΔ2723。由此可知,NTSN2723和NTSN1086都是Lm重要的毒力相关因子,前者在Lm定植结肠、肠系膜淋巴结和肝脏时发挥作用,后者在Lm定植多个脏器中发挥重要作用。综上所述,对NTSN1086和NTSN2723突变株的生物学特性研究结果显示,N TSN1086在Lm菌体抗原特性中发挥关键作用;二者均参与了细菌形态结构的维持和抗胁迫作用;在体内不同器官中的定植作用有所差异,协同在李斯特菌的感染与毒力中发挥重要作用。由此表明NTSN1086和NTSN2723是Lm的重要毒力相关因子,有望成为新的抗微生物药物靶标,对李斯特菌病的防控具有重要的临床和公共卫生意义。