氢气（H₂）和一氧化氮（NO）作为信号分子,是调控植物生长发育的关键因子。先前的研究已经表明H₂和NO可以促进植物不定根的形成。但是,H₂和NO促进植物不定根生长的机制多停留在NO含量和调控抗氧化酶等的研究。质膜H⁺-ATPase和14-3-3蛋白是植物中普遍存在的蛋白,他们同样也可以参与调控植物生长发育。质膜H⁺-ATPase和14-3-3的蛋白互作可调控植物的各种代谢过程。但是,在H₂和NO促进不定根发生过程当中对质膜H⁺-ATPase和14-3-3蛋白的表达及其互作的影响是不清楚的。因此,本研究以?新春4号?黄瓜为试验材料,研究在NO和H₂条件下质膜H⁺-ATPase和14-3-3蛋白的表达及互作对黄瓜不定根形成的影响,以期为NO和H₂之间的信号互作提供一个理论依据。研究的主要结果与结论如下:1.富氢水（HRW）和NO供体硝普钠（SNP）处理的黄瓜外植体,其不定根的根数、根长和鲜重均显著高于蒸馏水（CK）处理,且呈剂量依赖模式（1%-50%）;50%HRW和50μM SNP效果最佳,所以分别选用这两个浓度进行后续试验。2.HRW和SNP共处理的黄瓜不定根根数、根长和鲜重均显著高于HRW和SNP单独处理;HRW和NO清除剂（cPTIO）或NO抑制剂（Tungstate）处理的黄瓜不定根根数、根长和鲜重均显著低于HRW单独处理;说明NO参与H₂诱导黄瓜的不定根形成。3.H₂和NO单独处理的质膜H⁺-ATPase和14-3-3的蛋白表达和基因表达[HA3和14-3-3（7）]均显著高于CK处理;H₂和NO共处理的质膜H⁺-ATPase和14-3-3的蛋白表达和基因表达均显著高于H₂和NO单独处理;H₂+cPTIO处理可以逆转NO对质膜H⁺-ATPase和14-3-3的蛋白表达和基因表达的效果。同时,质膜H⁺-ATPase的酶活和H⁺泵活性也有相同的变化。说明NO通过调控质膜H⁺-ATPase和14-3-3的蛋白表达和基因表达来参与H₂诱导黄瓜不定根的形成。4.H₂和NO单独处理的质膜H⁺-ATPase和14-3-3的蛋白互作程度均显著高于CK处理;H₂和NO共处理的质膜H⁺-ATPase和14-3-3的蛋白互作程度均显著高于H₂和NO单独处理;cPTIO可以逆转NO对质膜H⁺-ATPase和14-3-3蛋白的蛋白互作程度。同时,质膜H⁺-ATPase磷酸化程度也有相同的变化。说明NO通过调控质膜H⁺-ATPase和14-3-3的蛋白互作来参与H₂诱导黄瓜不定根的形成。5.壳梭孢素（FC）为质膜H⁺-ATPase和14-3-3的蛋白互作的激活剂,腺苷-5’-单磷酸（AMP）为质膜H⁺-ATPase和14-3-3的蛋白互作的抑制剂。FC处理的黄瓜不定根根数、根长和鲜重均显著高于CK处理;随着FC浓度增加,黄瓜不定根根数、根长和鲜重均显著增加。其中,1μM FC效果最佳。AMP处理的黄瓜不定根根数、根长和鲜重均显著低于CK处理;随着AMP浓度增加,黄瓜不定根根数、根长和鲜重均显著减少。其中,20μM AMP效果最佳。FC处理的质膜H⁺-ATPase的酶活和H⁺泵活性均显著高于没有FC处理的各个处理;AMP处理的质膜H⁺-ATPase的酶活和H⁺泵活性均显著低于没有AMP处理的各个处理;质膜H⁺-ATPase和14-3-3的基因表达和蛋白表达也有相同的变化;验证了NO通过调控质膜H⁺-ATPase和14-3-3的蛋白互作来参与H₂诱导黄瓜不定根的形成。