结肠癌(Colon cancer)是世界范围内常见的消化系统恶性肿瘤,在我国,目前已经成为发病率上升最快的恶性肿瘤之一,严重威胁着人们的生命健康。然而,结肠癌的具体发病机制尚不明确,探求其发生发展机制和有效的治疗药物对于指导科研和临床具有重要意义。氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT),分子式为C15H24N2O,属于四环类喹诺里西啶生物碱(quinolizidine),是从中药苦参(Sophora flavescens A it)、苦豆子(S.Alopecuroides L)及广豆根(S.Subprostrata Chun etT.Chen)中提取与分离的一种中药单体,具有广泛的药理学作用和生物学活性,如抑制病毒生长、抑制炎症因子作用、保肝、扭转心律失常、增强和调节免疫功能及降低纤维化等作用。尤其是近年来,OMT的抗癌特性受到人们广泛的关注,有报道,其对肝癌、胃肠癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、视网膜母细胞瘤及白血病等多种恶性肿瘤表现出生长负向作用。现有研究证据发现,OMT具有抑制恶性肿瘤细胞增殖、诱导恶性肿瘤细胞周期停滞、抗肿瘤周围血管形成、诱导癌细胞向正常细胞分化、促进癌细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭及迁移等作用。特别在结肠癌相关实验中发现,OMT可抑制HT-29、SW1116、LOVO等多种结肠癌细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。KLF4(Krüpple like factor 4)属于锌指型转录因子的家族,参与调控正常细胞生长、增殖、分化、凋亡、代谢及维持正常组织的稳态,同时也与恶性肿瘤的发生机制有着非常紧密的联系。研究表明,KLF4在胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、皮肤癌等多种恶性肿瘤中低表达,可能表现为抑癌作用,但在原发性乳腺导管癌、前列腺癌、口腔鳞癌等呈现高表达水平,可能表现为促癌作用。因此人们认为KLF4具有正负双向调节作用,与多种靶基因结合,产生不同作用,可以表现激活或抑制转录,故KLF4在不同类型的癌组织中,呈现出癌基因和抑癌基因的不同属性。目前研究已证明KLF4能够抑制多种恶性癌细胞增殖、迁徙及侵袭,特别是在结肠癌RKO细胞中,质粒转染KLF4基因使其高表达后,发现细胞内p21基因表达增多,并且阻滞G1/S细胞周期。进一步研究发现,γ射线照射结肠癌hct116细胞后,若klf4基因存在,可以抑制中心体扩增从而抑制肿瘤细胞的增殖,如果klf4基因表达呈现缺失,将导致染色体呈现不稳定状态。现有的实验证据表明,klf4在消化道上皮是一个重要的抑癌基因,然而klf4是否参与抑制结肠癌细胞增殖及其分子机理尚不完全明确。本实验系统地研究klf4在结肠癌组织中的表达水平、探求omt对结肠癌细胞增殖的影响及klf4在其中发挥作用的机制,使进一步探求结肠癌的治疗靶标获得理论依据。目的:探讨结肠癌及癌旁组织临床样本中klf4表达水平。探讨omt对结肠癌细胞中klf4表达的影响。探讨klf4在omt抑制结肠癌细胞增殖过程中产生的效应。方法:1收集结肠癌组织和相应的癌旁组织各30例,分别经由rt-pcr及western-blot方法检测klf4mrna及蛋白表达情况,反应结肠癌组织及癌旁组织中klf4的表达水平。2培养结肠癌ht-29细胞株,配制不同浓度的omt的培养液药物处理结肠癌细胞,并建立空白对照,从中提取rna及蛋白,分别使用rt-pcr和western-blot方法,检测标本中klf4mrna及蛋白表达情况,以此反应omt对结肠癌细胞中klf4表达的影响。3利用klf4sirna瞬时转染经过omt处理的结肠癌ht-29细胞株,下调细胞中klf4基因的表达,培养沉默表达klf4的结肠癌细胞株,mtt实验方法检测细胞增殖的能力。结果:1结肠癌及癌旁组织中klf4表达水平采用rt-pcr及western-blot方法检测结肠癌及癌旁组织中klf4的表达。结果显示,结肠癌组织中klf4mrna及蛋白水平均明显低于癌旁组织,差异均有统计学意义(p<0.05)。2omt对结肠癌细胞中klf4表达的影响采用rt-pcr及western-blot方法检测用含有不同浓度omt细胞培养液培养的结肠癌ht-29细胞株中klf4的表达。结果显示,随着omt浓度的增加,KLF4 mRNA及蛋白水平明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明OMT可明显诱导细胞中KLF4表达。3 KLF4在OMT抑制结肠癌细胞增殖过程中产生的效应利用KLF4 siRNA(KLF4特异性小干扰RNA)转染结肠癌HT-29细胞株,敲减细胞内KLF4的表达,再观察OMT对结肠癌细胞增殖的影响。结果显示,敲减KLF4后,结肠癌细胞增殖能力增强,OMT抑制结肠癌细胞增殖的作用明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。表明KLF4介导了OMT抑制结肠癌HT-29细胞增殖过程。结论:1在结肠癌中,KLF4蛋白的表达低于癌旁组织,KLF4可能对结肠癌的表现为负向调控作用,是结肠癌的抑癌基因。2 OMT在结肠癌中促进KLF4基因的表达,OMT对结肠癌的发生可能具有抑制作用。3沉默KLF4后,OMT抑制结肠癌增殖的作用明显下降,OMT可能是通过KLF4这个关键基因来实现其抑制结肠癌增殖的效应。