水牛是南方的重要品种资源,具有较强抗病抗逆耐粗的能力,而且水牛奶具有高蛋白高乳脂率的特征,将是南方鲜奶和高端奶的重要来源。我国政府大力支持在南方养殖奶水牛,然而水牛的繁殖性能较低,是水牛业发展的瓶颈问题。抑制素(Inhibin, INH)、卵泡抑素(Follistatin, FST)对促卵泡素(Follicle-stimulating hormone, FSH)具有反馈调控作用,从而在一定程度上影响卵巢功能及卵泡发育。目前已开展了许多有关INH或FST单个基因免疫和提高动物繁殖力的研究,并取得了较好的效果；利用转基因和RNAi技术同时抑制INH和FST表达是否可以调控水牛卵巢功能和卵泡发育及提高繁殖性能,以及提高FSHβ表达水平对生殖生理和繁殖性能的影响,这方面报道还不多。PiggyBac转座子(PB)是一种DNA转座子,已作为基因转移和插入诱变等基因研究的有效工具,广泛应用于哺乳动物基因功能和转基因的研究。本研究利用PB转座系统,构建了同时干扰INHA和FST的双干扰载体,在细胞水平分析表达和干扰效率、筛选稳定整合的阳性细胞；构建含有水牛卵巢特异性启动子的FSHβ表达载体,分析其特异表达特性和表达效率。为水牛基因功能、卵巢功能和卵泡发育调控机理及转基因技术打下基础。本研究的主要结果如下：(1)针对INHA和FST基因序列设计RNAi干扰片段,构建了含有两个转录元件的双干扰载体pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2。(2)比较分析了双干扰载体的瞬时转染和与PB转座酶共转染的转染效率。分别利用瞬时转染和共转染方法转染水牛卵巢颗粒细胞(Buffalo fetal fibroblast cells, BuGCs)和水牛胎儿成纤维细胞(Buffalo fetal fibroblast cells, BuFFs),分别统计转染第24h、48h和72h时载体中绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中绿色荧光表达量。在转染24h时瞬时转染的细胞转染率高于共转染,而在其它时间共转染的转染效率均高于瞬时转染。(3)证明了双干扰载体pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2对INHA和FST基因具有一定的抑制效果。通过Q-PCR检测,细胞内INHA和FST的mRNA的表达均因RNAi而有所减少,其中INHA在共转染BuGCs时被干扰程度最大(37.37%),其表达量显著地低于空白对照组；在瞬时转染黄牛卵巢颗粒细胞(Bovine granulosa cells, BGCs)中FST干扰率为3.55%。(4)筛选出了INHA和FST基因RNAi片段稳定整合到基因组的阳性细胞。经G418筛选转染细胞,观察荧光表达情况,转染第7天后BuGCs和BuFFs荧光表达基本稳定,并且通过PCR鉴定转染后细胞基因组含有PB转座子的序列。(5)构建了分别含卵巢特异性启动子CYP19、OSP-1(广西大学惠赠)的pB-CYP19和pB-OSP1表达载体；(6)构建了水牛FSHβ全长cDNA的卵巢特异表达的pB-CYP19-FSHβ和pB-OSP1-FSHβ载体；(7)证明了两个表达载体具有卵巢特异表达的特性,pB-OSP1-FSHβ载体超表达效率较高。将两个载体分别转染BuGCs和BuFFs,利用RT-PCR技术检测出了BuGCs的FSHβ表达,而在BuFFs中却没有表达,证明了这两个载体具有水牛卵巢特异表达特性：而且pB-OSP1-FSHβ载体的FSHβ表达效率(13.04%)高于PB-CYP19-FSHβ载体(1.2%),故pB-OSP1-FSHβ载体可用于水牛卵泡发育等繁殖调控的研究；同时也证明OSP-1是水牛卵巢特异表达的有效启动子。