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目的:从泛素蛋白酶体途径对TLR信号通路的调控研究补肾方的抗肝损伤机制。方法:研究分为两个部分,第一部分为补肾方抗肝损伤作用研究,第二部分为补肾方抗肝损伤的作用机制研究。第一部分补肾方抗肝损伤作用研究:将正常鼠、HBV转基因鼠各取35只,雌雄各半,随机分为正常组、模型组、补肾全方组和拆方组(补肾阴组、补肾阳组、清化湿热组、引经药组)。每天同一时间给药1次,连续一周给药,第7天给药结束4h后,各组小鼠(正常组除外)均尾静脉注射刀豆蛋白A 15mg/kg,18h后摘眼球处死老鼠。检测肝功能、肝脏病理组织学、外周血相关炎症因子。第二部分补肾方抗肝损伤的作用机制研究:将正常鼠、Nrdpl基因敲除鼠各取35只,雌雄各半,随机分为正常组、模型组、补肾全方组和拆方组(补肾阴组、补肾阳组、清化湿热组、引经药组)。造模给药方法同第一部分。ELISA法检测TLR信号通路介导的相关炎症因子,Westrn Blot法检测TLR通路中关键蛋白 TBK1、IRF3、TLR9、TLR4、TLR3、TRAF6、NF-kB、TRIP、MyD88 的表达。结果:第一部分补肾方抗肝损伤作用研究:1.对肝功能指标的影响。正常小鼠中补肾全组、补肾阴组、清化组的ALT均显著下降(P<0.001);补肾全组的AST(P<0.05)、TBIL(P<0.05)和补肾阳组的 ALT(P<0.05)、AST(P<0.05)和清化组的TBIL(P<0.05)和引经药组的ALT(P<0.05)显著下降;补肾全组的 DBIL(P<0.01)、补肾阳组的 DBIL(P<0.01)、清化组的 DBIL(P<0.01)显著下降,补肾全组的ChE(P<0.01)显著升高;HBV转基因小鼠补肾全组的ALT(P<0.01)、TBIL(P<0.01)和补肾阳组的 ALT(P<0.01)和清化组的 ALT、DBIL(P<0.01)显著下降,补肾阴组的ChE(P<0.01)显著升高;补肾全组的AST(P<0.05)、DBIL(P<0.05)和补肾阴组的 ALT(P<0.05)、TBIL(P<0.05)和补肾阳组的DBIL(P<0.05)显著下降,补肾全组的ChE(P<0.05)显著升高。2对肝脏病理组织学的影响。正常小鼠与HBV转基因小鼠中补肾全组、补肾阳组中坏死区域的面积与模型组相比显著减小,其余给药组坏死区域的面积有所减小。3.对外周血相关炎症因子表达的影响。给药后,正常小鼠中补肾全组IL-1(P<0.05)、IL-6(P<0.05)、IFN-γ(P<0.05),TNF-α(P<0.01)表达显著降低;补肾阳组IL-1(P<0.05)、IFN-γ(P<0.05)表达显著降低;补肾阴组IL-6(P<0.05)、IFN-γ(P<0.05)表达显著降低。HBV转基因小鼠中补肾全组IL-1(P<0.01),TNF-α(P<0.05)、IL-6(P<0.05)表达显著降低;补肾阳组 IL-1(P<0.01),TNF-α(P<0.05)表达显著降低;补肾阴组 IL-1(P<0.05)、IL-6(P<0.05)表达显著降低;清化组IL-1(P<0.05)、引经药组IL-1(P<0.05)表达显著降低。第二部分补肾方抗肝损伤的作用机制研究:1.对肝功能指标的影响。正常小鼠(Nrdp1未敲除)中补肾全组的ALT(P<0.001)表达显著下降,补肾全组的AST(P<0.01)、TBIL(P<0.01),补肾阳组的 ALT(P<0.01),补肾阴组的 ALT(P<0.01)表达显著下降;补肾全组的ChE(P<0.01)、补肾阴组的ChE(P<0.01)表达显著升高;补肾全组的 DBIL(P<0.05),补肾阳组的 AST(P<0.05)、TBIL(P<0.05),补肾阴组的 AST(P<0.05)、TBIL(P<0.05)、DBIL(P<0.05),清化组的 ALT(P<0.05)、AST(P<0.05)、TBIL(P<0.05)、DBIL(P<0.05)以及引经组的ALT(P<0.05)表达显著降低;补肾阳组的ChE(P<0.05),清化组的ChE(P<0.05)表达显著升高。Nrdp1敲除小鼠中补肾全组的ALT(P<0.001)表达显著下降,补肾全组的TBIL(P<0.01),补肾阳组的ALT(P<0.01),补肾阴组的ALT(P<0.01),清化组的TBIL(P<0.01)表达显著下降;补肾全组的AST(P<0.05)、DBIL(P<0.05),补肾阳组的 AST(P<0.05)、TBIL(P<0.05),DBIL(P<0.05),补肾阴组的 AST(P<0.05)、TBIL(P<0.05)、DBIL(P<0.05),清化组的 ALT(P<0.05)、AST(P<0.05)、DBIL(P<0.05)以及ALT(P<0.05)表达显著降低;补肾全组的ChE(P<0.05),补肾阳组的ChE(P<0.05),补肾阴组的ChE(P<0.05),清化组的ChE(P<0.05)表达显著升高。2.TLR信号通路介导的相关炎症因子表达。正常小鼠(Nrdp1未敲除)和Nrdp1敲除小鼠中补肾全组的TNF-α(P<0.0001)、IL-6(P<0.0001)、IL-1(P<0.0001)和 TNF-β(P<0.0001)显著降低,Nrdp1 敲除小鼠中补肾阳组的 IL-6(P<0.0001)、IL-1(P<0.0001)、TNF-β(P<0.0001)和清化组的 TNF-α(P<0.0001)、IL-6(P<0.0001)、IL-1(P<0.0001)表达均显著降低。正常小鼠(Nrdp1未敲除)中补肾阳组的TNF-α(P<0.001)、IL-6(P<0.001)和TNF-β(P<0.001)表达均显著降低。3.对TLR信号通路中关键蛋白的影响。正常小鼠(Nrdp1 未敲除)补肾全组中 TLR9(P<0.001)、TLR3(P<0.001)、NF-kB(P<0.0001)和 TLR4(P<0.0001)显著下降;补肾阳组中 TLR9(P<0.001)和MyD88(P<0.0001)显著下降;补肾阴组中 TLR3(P<0.001)、MyD88(P<0.001)、NF-kB(P<0.01)显著下降。Nrdp1敲除小鼠补肾全组中TLR4(P<0.001)、MyD88(P<0.001),TLR3(P<0.01)和 NF-kB(P<0.01)显著下降;补肾阳组中 TLR4(P<0.001)、MyD88(P<0.01)和 TRAF6(P<0.05)显著下降;补肾阴组中MyD88(P<0.01)、NF-kB(P<0.01)显著下降。结论:1.补肾方具有显著抗肝损伤作用。2.拆方研究表明补肾阳组具有更好的降低ALT、AST、IL-1、TNF-α水平的作用,补肾阴组具有更好的升高ChE水平,降低IL-6、IFN-γ水平的作用,清化组具有更好的降低TBIL、DBIL水平的作用,说明不同拆方具有协同效应共同发挥抗肝损伤作用。3.Nrdp1基因敲除小鼠中,补肾方对TLR信号通路关键蛋白表达具有抑制作用,正常小鼠(Nrdp1未敲除)中,补肾方对TLR信号通路关键蛋白表达具有更强的抑制作用,可表明补肾方具有泛素连接酶样作用,通过泛素蛋白酶体途径调控TLR的炎症信号通路,最终实现其抗肝损伤效应。