研究背景及意义动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要发病原因。动脉粥样硬化的原因非常复杂,内皮功能障碍、细胞凋亡、血脂异常、炎性细胞浸润、脂质沉积、氧化应激、胶原代谢异常、血管生成等因素均在动脉粥样硬化的发生和发展中起作用。其中,内皮功能障碍在动脉粥样硬化的早期阶段发挥了主要的作用。所以,维持内皮的正常功能对于预防动脉粥样硬化有重大的意义。重金属离子镉(Cadmium, Cd)是一种不可降解的污染物,严重危害人体健康。环境中的镉不能被生物降解,导致含量逐年上升,被某些植物摄取而进入食物链。人类从食物、水、空气和土壤中接触镉,镉极易在体内蓄积,半衰期长达10-30年,对心血管系统、肾脏、肝脏、肺及睾丸等器官系统产生一系列损害。环境中的镉进入人体后会沉积在心脏和血管,心血管系统是镉毒性作用的靶器官之一。实验证据表明镉对动脉粥样硬化的起始有一定作用并能促进其发展。研究发现,镉能导致内皮功能障碍,加速动脉粥样斑块形成；能增加活性氧的形成,通过结合金属硫蛋白干扰氧化应激反应。另外,镉也可以通过升高血压、肾脏损伤、镉相关的雌激素活性改变或表观遗传变化来影响动脉粥样硬化的发生发展。镉毒性的机制很复杂,主要包括抑制锌指蛋白的功能、调节细胞内钙信号、改变活性氧、抑制DNA修复等。但是这些机制与镉诱导的动脉粥样化形成的相关性还不甚明确。在蛋白质的翻译后修饰中,可逆性蛋白磷酸化/去磷酸化的调节需要蛋白激酶和蛋白磷酸酶的共同参与,这一过程参与了几乎所有细胞功能的调控,包括细胞生长、免疫应答及细胞代谢等。人类蛋白磷酸酶家族包括大约100种酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase, PTP)和40种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,后者需要金属离子激活一个水分子来实施其去磷酸化的作用。蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase2C, PP2C),即Mn2+/Mg2+依赖性蛋白磷酸酶(protein phosphatase magnesium/manganium-dependent, PPM),二价金属离子与其结合后可以发挥激活或抑制其磷酸酶活性的作用。最近研究发现,哺乳动物中PP2C家族的16种基因至少编码了22种亚型。这些蛋白在调节应激信号通路、信使RNA前体的剪接、蛋白泛素化和降解、细胞代谢以及细胞死亡/存活信号通路中起着重要的作用。PPMlA,亦称PP2Cα,是PP2C家族中最具代表性的成员,在几乎所有的组织都有表达,参与了很多重要信号通路的调节。已报道PPM1A可以去磷酸化腺苷活化蛋白激酶,进而抑制其活化,在保证心血管系统的稳态中起了重要作用。PPM1A是丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路中重要的负调控因子,可抑制c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)和p38MAPK的活化。作为PP2C家族的典型代表,PPM1A可被Mn2+Mg2+、Fe2+等激活,可被Ca2+抑制,但能否被Cd2+抑制仍不清楚。以往研究表明,长期接触Cd2+会降低蛋白磷酸酶5和蛋白磷酸酶2A的A亚基的蛋白水平,但是Cd2+是否是通过直接结合蛋白激酶或蛋白磷酸酶来调节蛋白的磷酸化水平还未曾进行过深入的研究。进一步研究Cd2+与磷酸酶的相互作用,对于治疗镉对机体的毒性包括镉对动脉粥样硬化的促进,具有重要意义。整个论文分为三大部分,第一部分,我们研究了不同金属离子对PP2C家族的作用,发现Cd2+可以特异而有效地抑制PPM1A和PPM1G,抑制常数Ki小于1μM；第二部分,我们重点探讨了Cd2+对PPM1A和PPM1G的抑制作用及机制,发现Cd2+是通过作用于PP2C的M1金属离子结合位点发挥抑制作用的；第三部分,我们发现低浓度的Cd2+可以在一定程度上抑制PPM1A引起的人脐静脉内皮细胞的凋亡,而高浓度的Cd2+可以通过氧化应激导致细胞凋亡,对进一步探讨Cd2+与动脉粥样化发生发展的关系具有重要意义。第一部分金属离子对蛋白磷酸酶2C的作用研究目的探讨二价金属离子对PP2C磷酸酶家族的作用。研究方法1.质粒构建与蛋白纯化将PPM1A、PPM1G野生型序列亚克隆到pet30a原核表达载体上,通过Ni-NTA亲和层析进行蛋白纯化。2.酶动力学研究(1)对小分子底物磷酸对硝基苯酯(p-nitrophenylphosphate,pNPP)的磷酸酶活力测定：分别在Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、zn2+、Hg2+、Ca2+、Sr2+、Cr2+、Ba2+和Li+存在的条件下,测定PPM1A或PPM1G对pNPP的去磷酸化活性。(2)对ppERK短肽、pp38短肽磷酸酶活力：短肽作为底物,Mn2+作为激活剂,Cd2+作为抑制剂。(3)对体外纯化pERK2蛋白的磷酸酶活力：磷酸化pERK2蛋白作为底物,Mn2+作为激活剂,Cd2+作为抑制剂。结果Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+和Ni2+可以激活PPM1A和PPM1G,其激活能力：Fe2+>Mn2+>Mg2+>Co2+>Ni2+；Cd2+、Zn2+、Hg2+、Ca2+、Sr2+、Cr2+、Ba2+和Li+可以抑制PPM1A和PPM1G的活性,其抑制能力：Cd2+>Zn2+>Hg2+>Ca2+>Sr2+>(Cr2+,Ba2+)>Li+。Cd2+是PP2C家族特异而有效地抑制剂。第二部分镉通过作用于PP2C的M1金属离子结合位点抑制PP2C的活性研究目的研究Cd2+对PP2C抑制作用的分子机制。研究方法1.质粒构建与蛋白纯化将PPM1A、 PPM1G野生型序列亚克隆至pet30a原核表达载体和pcDNA3.1真核表达载体上,并以该表达质粒为模板构建一系列的突变。pet30a-PPM1A、 pet30a-PPM1G及其突变的表达和纯化通过tNi-NTA亲和层析进行蛋白纯化。2.野生型PPM1A、 PPM1G及不同突变体的酶动力学研究1)对小分子底物pNPP的磷酸酶活力：pNPP作为底物,Mn2+作为激活剂,Cd2+作为抑制剂。2)对体外纯化pERK2蛋白的磷酸酶活力：磷酸化pERK2蛋白作为底物,Mn2+作为激活剂,Cd2+作为抑制剂。3.细胞功能检测1)细胞内MAPK信号通路及Akt信号通路人胚胎肾293细胞(Human Embryonic Kidney293cell, HEK293)转染野生型PPM1A、 PPM1G及其突变后,加入Cd2+孵育,检测Cd2+抑制PPM1A、 PPM1G或其突变后,pERKl/2、 pP38、pJNK及pAKT的磷酸化水平。2)细胞周期HEK293细胞转染野生型PPM1A后,加入Cd2+孵育,检测Cd2+抑制PPM1A后,细胞周期的变化。结果1.Cd2+通过M1金属离子结合位点抑制UPPM1A和PPM1G的磷酸酶活性。PPM1A的第60位的天冬氨酸(D60)、第239位的天冬氨酸(D239)和第282位的天冬氨酸(D282)共同组成了PPM1A的M1金属离子结合位点。同理,PPM1G的D60、第441位的天冬氨酸(D441)和第496位的天冬氨酸(D496)共同组成了PPMIG的M1金属离子结合位点。D60A和D60N这2个突变体降低了Mn2+与酶的结合能力,同时也降低了Cd2+的抑制作用。除此之外,PPMIA的D239和D282突变及PPM1G的D441和D496突变也大大降低了Cd2+的抑制效能。相反,组成M2金属离子结合位点的氨基酸突变后,对Cd2+的抑制作用没有太大影响。2.Cd2+无法抑制M1金属离子结合位点的相关突变体对蛋白底物去磷酸化作用。1.5μM的Cd2+即可充分阻断野生型PPM1A和PPM1G催化的pERK蛋白的去磷酸化作用。但是1.5μM Cd2+却无法阻断D282A和D239K对pERK蛋白的去磷酸化作用。3.在细胞内低浓度的Cd2+可以抑制PPMIA和PPM1G调节的信号通路。HEK293细胞过表达PPM1A或D239K突变后,pERK、p38和pJNK的磷酸化水平明显减少,但是加入1.5μM Cd2+孵育6小时后,PPMIA无法发挥对pERK、 p38及pJNK的去磷酸化作用,导致磷酸化水平增加；而相同浓度的Cd2+却无法抑制D239K突变对pERK、 p38及pJNK的去磷酸化作用。4.Cd2+可以反转PPMIA对细胞周期的阻滞作用。HEK293细胞过表达PPM1A后,导致细胞分裂停滞在G2/M期,但是加入1.5μM Cd2+孵育24小时后阻断了这一停滞。第三部分镉对人脐静脉内皮细胞的影响研究目的探讨Cd2+对人脐静脉内皮细胞的影响。研究方法1.细胞培养及Cd2+处理人类脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)培养于含有0.1mg/ml肝磷酯、0.03-0.05mg/ml内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growth supplement, ECGS)和10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的F-12K培养基中。用不同浓度的Cd2+处理不同的时间后进行后续实验。2.MTT法检测Cd2+对细胞增殖的影响,Tunel法检测Cd2+对细胞凋亡的影响(1)分别检测不同浓度的Cd2+孵育细胞24个小时后,及10州的Cd2+孵育细胞不同时间后,细胞增殖及细胞凋亡的变化。(2)过表达PPM1A野生型质粒后,用1μM的Cd2+孵育细胞24个小时,检测细胞增殖及细胞凋亡的变化。(3)将细胞内源性PPM1A干扰后,用1μM的Cd2+孵育细胞24个小时,检测细胞增殖的变化。3.检测Cd2+对细胞内GSH和SOD活性影响用不同浓度的Cd2+处理细胞24个小时,检测细胞内GSH和SOD活性的变化。结果Cd2+对HUVECs增殖及凋亡的影响具有浓度依赖性和时间依赖性。低浓度的Cd2+会促进细胞增殖,而高浓度的Cd2+会促进细胞凋亡。另外,低浓度的Cd2+可以抑制PPMIA导致的细胞凋亡,高浓度的Cd2+可以通过增加氧化应激引起细胞凋亡。结论1. Mg2+、Mn2+、 Fe2+、Co2+和Ni2+可以激活PPMIA和PPM1G; Cd2+、Zn2+、 Hg2+、 Ca2+、Sr2+、Ba2+可以抑制PPMIA和PPM1G2.镉是PP2C有效的抑制剂,这一抑制作用是通过M1金属离子结合位点发挥作用的。3.在细胞内,镉抑制PPMIA调节的MAPK信号通路和PPM1G调节的AKT信号通路。4.镉能够反转PPMIA诱导的细胞周期阻滞。5.Cd2+对人脐静脉内皮细胞的增殖及凋亡的影响具有浓度依赖性和时间依赖性。6.低浓度的Cd2+可以抑制PPMIA导致的人脐静脉内皮细胞的凋亡。