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研究背景胰腺癌是一种难以早期诊断且对现有治疗不敏感的顽固性疾病,是死亡发病比最高的实体肿瘤之一,其以预后极差著称。众所周知,侵袭转移是恶性肿瘤的重要标志之一,而胰腺癌局部血管侵犯和远处转移均提示预后不良。因此,深入探讨胰腺癌侵袭转移的分子机制,将有助于优化治疗靶点,进一步改善患者的预后。局部黏着斑激酶（focaladhesion kinase,FAK）是一种功能复杂的酪氨酸激酶,已有较广泛的研究发现FAK在多种类型肿瘤的进展中,尤其在其侵袭转移中起到重要作用。然而,FAK调控胰腺癌侵袭转移等恶性生物学行为的分子机制的相关研究尚不充分。通过文献调研发现,在多种类型肿瘤中FAK通过调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）信号通路以及代谢重编程,促进肿瘤侵袭转移等恶性表型,但其在胰腺癌中尚未有报道。因此,本研究拟对以上问题做深入研究,以优化胰腺癌治疗靶点,为改善胰腺癌患者预后提供有效途径。研究目的探索FAK对胰腺癌增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响;探讨FAK对mTOR信号通路的调控作用,以及其对胰腺癌侵袭转移等恶性表型的影响,研究FAK通过调控胰腺癌代谢重编程,进而对其侵袭转移的影响;探索FAK在胰腺癌患者中的预后价值。研究方法利用实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹实验检测FAK在胰腺癌细胞系以及正常胰腺导管上皮细胞系中的表达情况;利用FAK瞬时敲减实验初步探索FAK对胰腺癌细胞体外增殖、迁移以及侵袭等恶性生物学行为的影响,并且检测mTOR信号通路的变化情况;通过慢病毒载体转染实验,筛选并建立FAK敲减、过表达以及相应对照组胰腺癌稳转细胞株;通过细胞增殖实验、细胞平板克隆形成实验以及裸鼠皮下移植瘤模型实验探索FAK对胰腺癌细胞增殖能力的影响,通过Transwell细胞迁移、侵袭实验与细胞划痕愈合实验探索FAK对胰腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响;验证FAK对mTOR信号通路的调控作用,并通过拯救实验探索FAK通过mTOR信号通路对胰腺癌侵袭转移等恶性表型的影响;利用细胞毒性实验探索FAK对胰腺癌细胞对mTOR抑制剂敏感性的影响;利用转录组测序与非靶向代谢组学检测探索FAK调控胰腺癌代谢重编程的具体代谢通路,并检测相关代谢通路上关键酶的表达情况;通过拯救实验探索FAK通过调控相关代谢酶对胰腺癌侵袭转移的影响;通过免疫组织化学染色评分,探索FAK在组织学水平的表达情况,通过ONCOMINE数据库与基因表达谱数据交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）数据库进行验证,并探索FAK与黏着斑调控蛋白之间的相关性;利用相关统计学方法分析FAK的表达水平与胰腺癌患者临床病理指标以及预后的关系。本研究所使用的统计学方法包括Student’st检验、Mann-Whitney U检验、Pearson卡方检验、Fisher精确检验、Kaplan-Meier生存分析以及Cox回归检验,P<0.05认为具有显著差异。研究结果1.FAK对胰腺癌恶性生物学行为的影响FAK在大多数胰腺癌细胞系中的表达水平均高于正常胰腺导管上皮细胞系。瞬时敲减FAK后发现AsPC-1与PANC-1胰腺癌细胞系体外细胞增殖、迁移以及侵袭能力较对照组细胞显著下降。上述结果在FAK敲减、过表达以及相应对照组胰腺癌稳转细胞株中得到了验证,即FAK敲减胰腺癌稳转细胞株体外增殖、迁移、侵袭以及体内成瘤能力较对照组显著下降;而FAK过表达胰腺癌稳转细胞株则相反。2.FAK调控胰腺癌侵袭转移等恶性表型的分子机制瞬时敲减FAK后发现AKT与mTOR的磷酸化水平较对照组出现下调。上述结果在胰腺癌稳转细胞株中得到了验证,即FAK敲减胰腺癌稳转细胞株中AKT、mTOR以及其下游信号分子的磷酸化水平较对照组显著下调;而FAK过表达胰腺癌稳转细胞株中上述分子的磷酸化水平较对照组显著上调,而总mTOR的表达水平在两组间无显著差异。FAK抑制剂GSK2256098可以下调胰腺癌细胞中AKT、mTOR信号通路的磷酸化水平,并抑制胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭以及划痕愈合。拯救实验发现mTOR抑制剂Rapamycin可以下调p70S6K、S6以及eIF 4EBP1的活化,并且部分逆转FAK对胰腺癌细胞侵袭转移等恶性表型的促进作用。此外,下调FAK可以提高胰腺癌细胞对mTOR抑制剂的敏感性。以上结果表明,FAK可以通过磷酸化激活mTOR信号通路促进胰腺癌细胞增殖、迁移以及侵袭等恶性表型,联合抑制FAK可以提高mTOR抑制剂的疗效。通过对转录组测序的差异表达基因进行富集分析后发现,FAK可能对胰腺癌代谢重编程存在影响。随后,通过对FAK敲减、过表达以及相应对照组胰腺癌稳转细胞株进行非靶向代谢组学检测发现,FAK对胰腺癌胆碱代谢存在潜在调控作用。进一步的研究发现,胆碱代谢关键酶CHKa的表达水平在FAK敲减稳转细胞株中出现下调,而在FAK过表达稳转细胞株中呈上调。敲减CHKa可以部分逆转FAK对胰腺癌细胞迁移与侵袭的促进作用。以上结果表明,FAK可以通过上调CHKa的表达水平,促进胰腺癌侵袭转移。此外,FAK与黏着斑调控蛋白TIAM2之间存在显著的相关性。3.FAK与胰腺癌患者预后的关系FAK在胰腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。此外,癌组织中FAK的高表达与肿瘤pN分期显著相关。FAK低表达患者较高表达组的预后好,且FAK在7个胰腺癌患者亚组中存在预后价值。此外,FAK高表达是胰腺癌患者预后不良的独立危险因素。结论FAK通过激活mTOR信号通路,促进胰腺癌增殖、迁移以及侵袭等恶性表型。此外,FAK对胰腺癌胆碱代谢存在调控作用,可以通过上调CHKa的表达水平促进胰腺癌侵袭转移。FAK可以作为胰腺癌患者潜在的预后标志物。