研究背景：皮肤是人体最大的器官，除了通过分泌、排泄和调节体温来参与机体的新陈代谢外，更重要的是它覆盖全身，是保护体内各组织和器官的屏障，因此十分容易受到损伤。皮肤缺损往往继发于创伤、手术、烧伤或一些代谢性疾病如糖尿病等，所以皮肤的损伤易伴发感染，形成坏疽，严重时甚至可以威胁生命，因此皮肤缺损的治疗，尤其是难愈合性创伤及大面积全层皮肤缺损，一直以来都是国内外皮肤及整形外科亟待解决的医学难题。近年来，组织工程快速发展，已有大量研究报道利用骨髓间充质干细胞（BMMSCs）作为种子细胞构建组织工程皮肤，通过间充质干细胞（MSCs）的自我更新、高度增殖与多向分化使其成为创伤愈合丰富的细胞来源，从而修复皮肤缺损。然而，现有的几种组织工程化皮肤虽然在治疗皮肤缺损上取得了一定成效，但它们大多只是在结构上与人体天然皮肤相似，虽然具有皮肤的屏障功能，但其韧性、外形以及机械性能仍明显不如天然皮肤，并且在免疫、物质及能量交换等功能方面上仍有较大差距，并没有实现真正意义上的皮肤重建。近来，MSCs的免疫调节能力受到越来越多的关注，应用其免疫调节特性来治疗各种疾病也显示了较传统治疗难以比拟的优势，然而巨噬细胞（mΦ）作为损伤愈合中的免疫明星细胞，其在MSCs的系统注射调节免疫从而促进皮肤损伤愈合中是否发挥作用，发挥怎样的作用却鲜有报道。明确各细胞在皮肤缺损的细胞治疗中发挥的作用有利于更深刻的理解MSCs在皮肤缺损修复中对病理过程的潜在影响，从而在临床上为皮肤缺损愈合的治疗手段提供新思路。　　研究目的：本实验目的在于筛选合适的种子细胞，探索干细胞治疗促进皮肤缺损愈合的可行性，明确其效应的靶细胞及可能作用机制，为临床治疗皮肤缺损修复再生提供一定的理论依据及治疗新思路。　　方法：　　1.体外组织块培养法和有限稀释法培养颌骨骨髓间充质干细胞（JMMSCs）；骨髓穿刺法和密度梯度离心法培养长骨骨髓间充质干细胞。流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记；克隆形成、细胞周期以及Cell count kit8（CCK8）检测细胞自我更新能力；细胞迁移实验比较两种细胞的迁移效率；成骨诱导后通过检测碱性磷酸酶（ALP）活性，ALP染色、茜素红染色，实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）及蛋白免疫印迹法（Western Blot）比较两种细胞成骨能力；成脂诱导后通过油红“O”染色，RT-PCR及Western Blot比较两种细胞脂向分化能力。　　2.建立小鼠皮肤缺损模型（n=48），随机分为A组（BMMSCs组，I.V.，2×106)，B组（JMMSCs组，I.V.，2×106）和对照组C组（PBS组，I.V.，200μL），观察不同时间点各组皮肤缺损愈合情况并进行组织切片的苏木素伊红（HE）、免疫组织化学及特殊染色，比较不同组别皮肤缺损愈合效率及炎细胞浸润，血管生成，生长因子分泌、细胞增殖及胶原纤维形成。　　3.CM-DIL染色对干细胞标记和体内示踪，免疫荧光染色探索创缘处“归巢”MSCs可能作用的靶细胞；通过氯膦酸二钠的脂质体（CL）尾静脉注射建立巨噬细胞删除小鼠模型，在此基础上行皮肤缺损（n=20），随机分为D组（BMMSCs（mΦ-）组，I.V.，2×106）及对照E组（PBS（mΦ-）组，I.V.，200μL），观察不同时间点皮肤缺损愈合大体情况并进行组织切片的HE、免疫组织化学及特殊染色，比较不同组别皮肤缺损愈合效率，血管生成，生长因子分泌、细胞增殖及胶原纤维形成。　　4.密度梯度法及磁珠分选分离出外周血中的单核细胞，将其与两种干细胞进行共培养，流式细胞仪与细胞免疫荧光检测巨噬细胞表面标志的变化，脂多糖（LPS）及白细胞介素（IL）-4分别刺激巨噬细胞得到M1、M2型巨噬细胞，RT-RCR检测共培养后的巨噬细胞与诱导得到的M1、M2型巨噬细胞M1/M2型相关基因mRNA表达水平差异，组织免疫荧光检测细胞治疗组（A、B组）和PBS组（C组）皮肤缺损周围组织巨噬细胞表面标志变化，RT-PCR和Western Blot分别检测组织中巨噬细胞M1/M2型极化相关基因及蛋白表达变化。　　结果：　　1.分离的JMMSCs和BMMSCs均阳性表达CD146、STRO-1、CD105，阴性表达CD31、CD34、CD45；JMMSCs的克隆形成率、增殖速度高于BMMSCs，流式细胞术检测显示JMMSCs处于增殖（S+G2）期的细胞占35.89％，多于BMMSCs的增殖期细胞所占百分比30.41%，而迁移速率上两者无明显差异；成骨诱导3、5、7天后，ALP活性检测及染色结果显示两种细胞的ALP活性随着时间上升且JMMSCs强于BMMSCs，诱导21 d后茜素红染色及定量显示JMMSCs矿化能力强于BMMSCs，RT-PCR和Western Blot显示相关成骨指标JMMSCs强于BMMSCs；成脂诱导后，油红“O”染色及定量、RT-PCR和Western Blot显示BMMSCs成脂能力稍强于JMMSCs组。　　2.从第6天开始，A、B两组小鼠皮肤缺损的愈合效率明显快于C组；Manson三色染色显示，A、B组形成的蓝色纤维较C组多且方向更整齐；HE染色显示治疗3天后，A、B两组伤口附近炎细胞浸润明显少于对照C组；免疫组化显示在细胞治疗后第9天时，A、B两组的增殖细胞核抗原（PCNA），血小板生成衍生因子（PDGF）和CD31阳性细胞多于C组。　　3.CM-DiL标记的MSCs大量“归巢”到皮肤缺损处，数量明显多于正常皮肤处的标记MSCs，并于与创缘周围大量CD68阳性的巨噬细胞在空间上有密切联系；流式细胞术检测小鼠CL注射后，外周血中高表达CD14中等表达CD45的单核细胞大量减少，脾和肝的中CD68阳性细胞较正常小鼠中减少，表明巨噬细胞删除小鼠模型建立成功；巨噬细胞删除小鼠的皮肤缺损进行细胞治疗后（D组），其愈合效率与PBS治疗的对照组（E组）没有明显差异，Manson三色染色显示D、E两组基本没有蓝色的胶原纤维形成；在细胞治疗的第9天，D、E两组的PCNA，PDGF和CD31免疫组化染色的阳性细胞数量没有明显差异。　　4.流式细胞仪、细胞免疫荧光检测显示与两种干细胞共培养后，表达M2型巨噬细胞标志CD206和CD163的巨噬细胞比例上升；RT-PCR检测经共培养的巨噬细胞表达M2型相关基因水平较LPS诱导的M1型巨噬细胞和未诱导组高，接近于经IL-4诱导的M2型巨噬细胞的表达水平。组织免疫荧光，RT-PCR及Western Blot都显示相较PBS组，MSCs治疗组皮肤缺损处巨噬细胞的M2型比例增加。　　结论：　　1.颌骨来源的JMMSCs是异于长骨骨髓来源的BMMSCs的独立细胞群体，其易于获得分离,在体外可以迅速扩增，在一定条件下同样也是合适的种子细胞。　　2.两种MSCs的系统注射均可促进伤口愈合，删除巨噬细胞后，不但MSCs的治疗效果消失，并且损伤愈合明显减缓，提示我们巨噬细胞在有无细胞治疗的皮肤损伤愈合中都发挥着重要作用，并且一些MSCs的治疗效应是通过巨噬细胞介导发挥的，因此针对巨噬细胞改进治疗方案可能是促进皮肤缺损愈合的新策略。　　3.MSCs在体内外均可诱导巨噬细胞向具有组织重构功能的M2型巨噬细胞极化是细胞治疗促进皮肤缺损愈合的可能机制。