类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎症为主要病理表现的炎性、慢性、系统性自身免疫病,其发病机制可能与T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和成纤维样滑膜细胞等各种细胞、炎症细胞因子共同作用有关,目前还没有令人满意的治疗方法。肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)在RA的发病机制中扮演重要角色,其与细胞上的肿瘤坏死因子受体(tumour necrosis factor receptor,TNFR)结合,在诱导RA炎症介质的产生、炎症细胞浸润、滑膜血管翳形成、骨侵蚀等病理生理过程中起重要作用。临床上,以依那西普(Etanercept)为代表的TNF-α抑制剂,在治疗中重度和难治性RA中起到举足轻重的作用。Etanercept是人可溶型肿瘤坏死因子受体Ⅱ(soluble tumour necrosis factor receptorⅡ,sTNFRⅡ)与人免疫球蛋白(immune globulin,Ig)G1的Fc段构建的融合蛋白,作为一种假受体,通过竞争性地结合TNF-α,阻断了TNF-α信号的传递,从而抑制细胞的活化。但是,由于其作用于单一靶点,不能从多个环节调控,发挥治疗作用,而且全身给药靶向性不强,并且可能引发感染、肿瘤和耐药等问题。因此,目前急需一种安全、有效、容易获取的载体,将药物送达患处,减少不良反应的发生。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。由于其具有免疫原性低、具有“归巢”至炎症部位促进组织再生和损伤修复能力、免疫调节能力、多向分化能力等特点,为免疫相关性疾病的治疗研究提供了新的思路。目前,已经有多项临床试验证实了使用MSC治疗RA的安全性和有效性。然而,有研究表明,炎性环境并不利于MSC发挥其治疗作用。炎性细胞因子(特别是TNF-α)能够诱导MSC发生自噬和凋亡,并且增加MSC中HLA-DR的表达,从而加速机体免疫细胞对MSC的清除,影响MSC的治疗效果。RA也是一种炎性、系统性自身免疫病,体内伴随多种炎性细胞因子水平的升高,那么MSC在RA炎性微环境中是否会发生凋亡和自噬,从而影响其疗效,目前还未见报道。因此,MSC在炎症性疾病治疗中的应用,应当考虑降低炎性微环境对其凋亡和自噬的诱导作用,从而提高MSC的治疗效果。随着组织细胞工程学和基因工程学的发展,以MSC作为生物活性物质的细胞载体,靶向治疗RA具有可行性,其突出特点可能包括:(1)MSC作为基因治疗的细胞载体。(2)基因修饰的MSC仍保留其免疫调节和分化特性,抑制炎症和修复受损的关节组织。(3)MSC基因修饰后增强某基因表达,基因修饰的MSC可以“归巢”到局部炎症受损部位,避免大剂量系统性给药带来的全身不良反应。本课题拟构建能够稳定表达sTNFRⅡ-Fc的人脐带MSC(umbilical cord derived-MSC,UC-MSC)稳定细胞株(sTNFRⅡ-MSC)。运用基因转染、Transwell小室、细胞流式术、Q-PCR等技术,研究sTNFRⅡ-MSC对RA经典动物模型(小鼠胶原性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA))的治疗作用和特点;体外在TNF-α的作用下,探讨sTNFRⅡ-MSC是否能够通过分泌sTNFRⅡ-Fc,结合并中和TNF-α,减少TNF-α诱导MSC的凋亡和自噬,从而更好地发挥其治疗作用,为临床治疗RA等自身免疫病提供新的治疗措施和实验依据。目的:构建sTNFRⅡ-Fc融合蛋白修饰的人UC-MSC(sTNFRⅡ-MSC)。明确sTNFRⅡ-MSC的体外和体内生物学特性,以及sTNFRⅡ-MSC对小鼠CIA的治疗作用,揭示sTNFRⅡ-MSC是通过怎样的机制,多靶点、多环节调节免疫反应而发挥作用。为临床治疗RA等自身免疫病提供新的治疗措施和实验依据。方法:1.采用全合成方法构建sTNFRⅡ和IgG1-Fc基因片段,两段基因中间用柔性肽(5’-GGAGGTGGAGGATCA-3’)连接,得到sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因,将其连接到GV358慢病毒质粒上,通过转化、鉴定、包装和纯化,获得sTNFRⅡ-Fc慢病毒载体。使用sTNFRⅡ-Fc慢病毒载体感染人UC-MSC,通过混合克隆法和有限稀释法构建稳定表达sTNFRⅡ-Fc融合蛋白的UC-MSC稳定细胞株sTNFRⅡ-MSC。2.细胞流式术检测sTNFRⅡ-MSC表面分子标志物(CD45、HLA-DR、CD34、CD90、CD73和CD105),检测sTNFRⅡ-MSC成骨、成软骨和成脂分化能力,用TNF-α和IL-1β刺激后,Western blot法和免疫荧光法检测sTNFRⅡ-MSC中VCAM-1和ICAM-1的表达。使用transwell小室共培养sTNFRⅡ-MSC和RA患者成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS),TNF-α和IL-1β刺激后,ELISA法检测共培养体系中RANKL和OPG的水平。用sTNFRⅡ-MSC和Etanercept预处理NOD/SCID小鼠,LPS腹腔注射诱导急性炎症,ELISA法检测0 h,1.5 h和6 h小鼠血清中人sTNFRⅡ、TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。3.使用鸡Ⅱ型胶原诱导建立小鼠CIA模型,尾静脉注射sTNFRⅡ-MSC或UC-MSC,皮下注射Etanercept,给药四周。观察各组小鼠整体指标(体重、关节炎指数和关节肿胀数)变化,胸腺和脾脏指数变化,对各组小鼠脾脏和踝关节病理进行评分,CCK-8法检测LPS和Con A诱导的脾脏和胸腺细胞增殖以及CCⅡ特异的CD4+T细胞增殖反应,ELISA法检测各组小鼠血清中IL-17、IL-4、IFN-γ、IL-10、IgG1、anti-CⅡ和IgG2a水平,流式细胞术检测CIA小鼠脾脏T和B细胞亚群变化,免疫组化法检测小鼠踝关节软骨和滑膜组织中ADAMTS-5、CollagenⅡ、MMP-13和TIMP-1的表达,免疫荧光法检测sTNFRⅡ-MSC在CIA小鼠脾脏和关节组织中的分布情况,免疫荧光法检测CIA小鼠脾脏留存的UC-MSC中LC3B-Ⅱ和cleaved caspase 3的表达情况。4.分离CIA小鼠CD4+T细胞,与sTNFRⅡ-MSC共培养,QPCR法检测CD4+T细胞中转录因子T-bet、GATA-3、ROR-γt、Bcl6和Foxp3的表达。5.用TNF-α和放线菌酮(Cycloheximide,CHX)处理sTNFRⅡ-MSC,Western Blot法检测sTNFRⅡ-MSC中Bax、Bcl2、Caspase 8、Caspase 3、Cleaved caspase8、Cleaved caspase 3、LC3B-Ⅱ和TRIB3蛋白的表达,Annexin V/PI法和TUNEL法检检测sTNFRⅡ-MSC凋亡。CCK-8法检测TNF-α诱导的凋亡和自噬对sTNFRⅡ-MSC免疫抑制能力的影响。用TNF-α刺激sTNFRⅡ-MSC,Western Blot法检测sTNFRⅡ-MSC中SOX-9和Aggrecan蛋白的表达。结果:1.成功构建sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株采用全合成方法得到sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因,将其连接到GV358慢病毒质粒上,通过转化、鉴定、包装和纯化,成功获得sTNFRⅡ-Fc慢病毒载体。使用sTNFRⅡ-Fc慢病毒载体感染人UC-MSC,筛选得到sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株,sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株的纯度可达98%以上。2.sTNFRⅡ-MSC的体外和体内生物学特性我们检测了sTNFRⅡ-MSC培养上清中人sTNFRⅡ的水平,结果显示,慢病毒转染后第一代和第三代sTNFRⅡ-MSC均能够分泌较高水平的sTNFRⅡ-Fc。那么sTNFRⅡ-Fc慢病毒转染后的UC-MSC是否还保留其固有生物学特性呢?我们发现,sTNFRⅡ-MSC几乎不表达CD45,CD34,HLA-DR,其阳性率均在2%以下;并且sTNFRⅡ-MSC高表达CD105,CD73和CD90,其阳性率均在99%以上。同时,sTNFRⅡ-MSC仍然保留成骨、成软骨和成脂分化能力。这些结果提示,sTNFRⅡ-MSC仍然保留UC-MSC的固有生物学特性。进一步我们检测sTNFRⅡ-MSC分泌的sTNFRⅡ-Fc在体外是否具有生物学效应。结果显示,sTNFRⅡ-MSC能够抵制TNF-α诱导的ICAM-1和VCAM-1的上调,而对IL-1β诱导的ICAM-1和VCAM-1的上调没有作用,并且sTNFRⅡ-MSC能够抵制TNF-α诱导的与RA患者FLS共培养体系中RANKL和OPG的上调,而对IL-1β诱导的共培养体系中RANKL和OPG的上调没有作用。这些结果提示,sTNFRⅡ-MSC分泌的sTNFRⅡ-Fc体外能够选择性中和TNF-α,从而发挥其生物学效应。在sTNFRⅡ-MSC体内生物学特性检测中我们发现,NOD/SCID小鼠腹腔注射LPS1.5 h后,sTNFRⅡ-MSC组小鼠血清中sTNFRⅡ的水平显著降低。NOD/SCID小鼠腹腔注射LPS 1.5 h后,EGFP-MSC组和Etanercept组小鼠血清TNF-α水平急剧增加,达到2000pg/ml左右,而sTNFRⅡ-MSC组小鼠血清TNF-α水平显著低于EGFP-MSC组和Etanercept组,LPS腹腔注射6 h后,sTNFRⅡ-MSC组小鼠血清TNF-α水平仍然显著低于Etanercept组。在NOD/SCID小鼠腹腔注射LPS 6h后,EGFP-MSC组和Etanercept组小鼠血清IL-1β和IL-6水平开始增加,sTNFRⅡ-MSC组小鼠血清IL-1β和IL-6水平显著低于EGFP-MSC组和Etanercept组。结果提示,sTNFRⅡ-MSC可以通过分泌sTNFRⅡ-Fc,从而阻断小鼠体内TNF-α的生物学功能,降低其他炎性因子水平。3.sTNFRⅡ-MSC对小鼠CIA的治疗作用sTNFRⅡ-MSC移植可明显恢复CIA小鼠体重,降低关节炎指数和关节肿胀数评分,降低CIA小鼠脾脏指数,降低脾脏和踝关节病理评分。sTNFRⅡ-MSC可明显下调LPS和Con A诱导的脾脏和胸腺细胞增殖以及CCⅡ特异的CD4+T细胞增殖反应。sTNFRⅡ-MSC可明显下调CIA小鼠血清中IL-17、IFN-γ、anti-CCⅡ、IgG2a的水平,明显上调IL-10和IL-4的水平。免疫组化结果显示,sTNFRⅡ-MSC移植可明显下调CIA小鼠踝关节软骨和滑膜组织中ADAMTS-5和MMP-13的表达,明显上调踝关节软骨中CollagenⅡ的表达,对软骨和滑膜组织中TIMP-1的表达无明显影响。流式细胞术结果显示,sTNFRⅡ-MSC移植可显著下调CIA小鼠脾脏Th1(CD4+IFN-γ+)、Th17(CD4+IL-17+)、Tfh(CD4+CXCR5+PD-1+)和浆细胞(CD19-CD138+)的比例,显著上调Th2(CD4+IL-4+)、Treg(CD4+CD25+Foxp3+)和Breg(CD19+IL-10+)比例。4.sTNFRⅡ-MSC对CIA小鼠脾脏CD4+T细胞相关转录因子表达的影响QPCR结果显示,sTNFRⅡ-MSC能显著下调CIA小鼠脾脏CD4+T细胞中转录因子T-bet、ROR-γt、Bcl6的表达,显著上调Foxp3和GATA-3的表达。5.sTNFRⅡ-MSC能够迁移到CIA小鼠脾脏和踝关节组织中,并且sTNFRⅡ-Fc基因修饰可以减少UC-MSC凋亡和自噬的发生免疫荧光结果显示,sTNFRⅡ-MSC尾静脉注射后,d 1到d 14均能在CIA小鼠脾脏和踝关节组织中检测到EGFP+CD105+sTNFRⅡ-MSC。我们在sTNFRⅡ-MSC尾静脉注射后d 7检测CIA小鼠脾脏组织中EGFP+sTNFRⅡ-MSC中LC3B-Ⅱ和cleaved caspase 3的表达,结果显示,与EGFP-MSC相比,sTNFRⅡ-MSC中LC3B-Ⅱ和cleaved caspase 3的表达明显减少。6.TNF-α能够诱导UC-MSC发生凋亡和自噬,降低其免疫抑制能力,sTNFRⅡ-MSC能够抵制TNF-α的这一作用Western Blot结果显示,TNF-α/CHX处理后,UC-MSC中Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8和LC3B-Ⅱ蛋白的表达明显增加,Bcl2、caspase-3、caspase-8和TRIB3蛋白的表达明显降低。Western Blot结果显示,TNF-α/CHX处理后,与UC-MSC组相比,sTNFRⅡ-MSC组中Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8和LC3B-Ⅱ蛋白的表达明显降低,Bcl2、caspase-3、caspase-8和TRIB3蛋白的表达明显增加。CCK-8结果显示,TNF-α诱导的自噬和凋亡降低UC-MSC的免疫抑制能力,而sTNFRⅡ-MSC可以抵制TNF-α功能。7.TNF-α对sTNFRⅡ-MSC向软骨细胞分化的影响Western Blot结果显示,TNF-α处理后,UC-MSC中SOX-9和Aggrecan蛋白的表达明显降低,而与EGFP-MSC相比,sTNFRⅡ-MSC中SOX-9和Aggrecan蛋白的表达明显增加。阿利新蓝染色结果显示,TNF-α处理后,在成软骨诱导培养液中的UC-MSC无法聚集成球状,而且阿利新蓝着色浅;与EGFP-MSC相比,成软骨诱导培养液中的sTNFRⅡ-MSC成球状生长,且阿利新蓝着色深。结论:1.本课题首次以UC-MSC为载体,利用慢病毒转染,成功构建稳定表达sTNFRⅡ-Fc融合蛋白的UC-MSC稳定细胞株(sTNFRⅡ-MSC),并且sTNFRⅡ-MSC仍然保留其MSC的固有生物学特性。2.sTNFRⅡ-MSC分泌的sTNFRⅡ-Fc融合蛋白在体内外均具有生物学效应,通过中和细胞培养上清和血清中的TNF-α发挥作用。3.与UC-MSC相比,sTNFRⅡ-MSC对CIA小鼠具有更好的治疗作用。sTNFRⅡ-MSC能够迁移至CIA小鼠脾脏和踝关节组织中,通过调控CIA小鼠T、B细胞活化和分化,降低炎性细胞因子水平和促进组织修复发挥其治疗作用。4.炎性环境不利于UC-MSC发挥其治疗作用。CIA小鼠体内的炎性环境以及体外TNF-α刺激均会诱导UC-MSC发生凋亡和自噬,影响UC-MSC发挥其治疗作用,而sTNFRⅡ-MSC能够通过中和TNF-α,降低炎性细胞因子水平,减少其凋亡和自噬的产生。5.TNF-α抑制UC-MSC向软骨细胞分化,影响UC-MSC的软骨修复功能,而sTNFRⅡ-MSC能够通过中和TNF-α,增强其软骨分化能力。