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[研究背景与意义]癌症是人类健康面临的重大难题,许多恶性肿瘤生长速度快,转移率高,并且肿瘤本身异质性强,因此发展以靶向治疗为基础的精准治疗显得尤为重要。异常激活的Wnt信号与肿瘤发生发展密切相关。靶向抑制Wnt信号途径是抗肿瘤的潜在治疗策略。目前,Wnt通路已成为抗肿瘤药物开发的重要靶标,而临床上尚无获批的靶向Wnt信号通路的治疗药物。因此,研发新型高效且低毒的Wnt通路抑制剂将为抗肿瘤药物开发奠定基础。肿瘤转移是导致癌症病人死亡的最主要原因。趋化因子受体(CXCR)4在多数癌症组织中呈现高表达且与不良的预后相关。CXCL12/CXCR4信号通路激活会促进肿瘤转移。比较有趣的是,CXCL12/CXCR4的激活会增强Wnt信号通路的β-catenin的积累。而且,越来越多的证据表明抑制CXCR4可增强化疗和肿瘤免疫治疗的作用,并降低转移性肿瘤的发展。许多肿瘤的单一药物治疗效果差,多靶点联合治疗肿瘤目前已备受关注。因此,探讨联合抑制Wnt与CXCL12/CXCR4信号通路在肿瘤治疗中的作用具有重要的意义。[研究目的](1)研发高效且低毒的Wnt通路小分子抑制剂用于治疗Wnt活化的肿瘤,并阐明其作用机制与抗肿瘤功能;(2)鉴定高效且低毒的CXCR4抑制剂,用于干预肿瘤转移;(3)明确Wnt抑制剂与CXCR4抑制剂联合应用的协同抗肿瘤效果,重点研究联合用药对Wnt活化且CXCR4高表达肿瘤的协同抑制作用。[研究方法]利用荧光报告检测体系筛选高效的Wnt通路小分子抑制剂,并且在自分泌激活体系以及旁分泌激活体系中研究其作用机制。而且,我们利用Wnt活化的肿瘤细胞包括持续自分泌Wnt配体蛋白的畸胎瘤细胞PA-1和Rnf43基因突变的人胰腺癌细胞AsPC-1深入研究Wnt抑制剂的潜在靶点。建立小鼠皮下移植瘤模型用于评估这些Wnt抑制剂在体内对肿瘤生长和Wnt信号通路的影响。此外,利用竞争结合实验筛选得到与CXCR4结合效率很高的小分子拮抗剂,进一步通过创伤愈合实验和侵袭小室实验验证了其抑制转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的抗肿瘤功能。并且,通过尾静脉注射肿瘤细胞建立小鼠肿瘤肺转移模型,并进一步评估CXCR4拮抗剂在体内对肿瘤转移的影响。最后,通过肿瘤细胞侵袭实验和克隆形成实验检测Wnt抑制剂联合CXCR4拮抗剂的协同抗肿瘤作用。[研究结果](1)研究发现PP327是一种高效的Wnt信号通路小分子抑制剂,同时抑制自分泌和旁分泌Wnt激活通路。PP327阻断了 PORCN介导的Wnt蛋白分泌,在细胞水平上对Wnt信号的抑制作用强于目前已进入Ⅱ期临床试验的PORCN抑制剂LGK974。(2)PP327在体内外实验中均能有效抑制Wnt信号通路的激活,包括PP327降低LRP6和Dvl2磷酸化水平以及Wnt靶基因Axin2的表达水平。(3)在小鼠耐受剂量范围内,PP327在Wnt激活的肿瘤(包括自激活畸胎瘤和Rnf43突变的胰腺癌)中具有显著的抗肿瘤活性。(4)开发了一种高效的CXCR4拮抗剂CXC188,在体外显著降低肿瘤细胞的侵袭和迁移。(5)CXC188有效抑制小鼠肿瘤细胞向肺转移,并且在有效剂量范围内无明显副作用。(6)在Wnt活化且CXCR4高表达的肿瘤细胞中,PP327和CXC188的联合作用较单一药物能更好地抑制肿瘤细胞的侵袭和克隆生长。[结论]综上所述,我们发现PP327是一种高效且低毒的Wnt信号通路抑制剂,其靶向PORCN蛋白。PP327在多种Wnt激活肿瘤的体内外实验中呈现有效的抗肿瘤活性。此外,还发现一种可口服吸收的CXCR4拮抗剂CXC188,其能有效地抑制肿瘤细胞的体外侵袭、迁移和体内转移。PORCN抑制剂和CXCR4拮抗剂的联合发挥协同抗肿瘤作用。