桦木酸是一种天然的五环三萜类化合物,可抑制多种肿瘤细胞系的增殖,且抑制机制具有细胞特异性,在不同细胞中的抑制靶点不尽相同。以往研究发现桦木酸可抑制宫颈癌细胞系生长,但抑制机理并不清楚,因此本论文以人宫颈癌细胞系HeLa为研究对象,解析桦木酸抑制细胞增殖和促进凋亡作用及其介导的信号转导通路,为深入阐明桦木酸抑制人宫颈癌细胞的增殖机制提供实验依据。1.不同浓度桦木酸处理HeLa细胞不同时间的结果证实桦木酸可有效抑制HeLa细胞增殖并引起细胞凋亡,且呈现时间和剂量依赖性。计算不同处理时间点下的半数抑制浓度(IC50),并结合细胞凋亡检测结果,为保证蛋白总量能够满足双向电泳要求,确定以30 μmol/L桦木酸处理HeLa细胞系48 h为双向电泳实验的处理条件。2.蛋白质组学分析显示,HeLa细胞中有36个蛋白质受桦木酸诱导差异表达,其中有6个上调蛋白质,30个下调蛋白质。功能学分析表明这些蛋白分别参与了细胞代谢、生化反应、蛋白定位等不同的生物学过程,而依据蛋白质的功能不同,又可将其分成催化功能型蛋白、氧化还原型蛋白、翻译调控型蛋白等。遗憾的是,依据蛋白质组学分析结果未能推测出与细胞增殖和凋亡直接相关的信号途径,但在差异表达蛋白中,14-3-3β蛋白和14-3-3ε蛋白在桦木酸作用下表达下调,且基因转录水平与蛋白变化趋势相一致。已有研究表明14-3-3蛋白家族在PI3K/Akt信号通路及线粒体凋亡信号通路中起到关键作用,为下一步实验提供了线索。3.桦木酸(30 μmol/L)作用HeLa细胞12 h后可显著抑制HeLa细胞增殖并诱导细胞凋亡。目标蛋白受桦木酸调控后显著变化的时间顺序为P13K(p110a)1h、Phospho-Akt(Ser473)2 h、Phospho-Akt(Thr308)2 h、p21Wan/Cip1 2 h、p27Kip 3 h、Bad 3 h、caspase-9 6 h。进而用不同剂量桦木酸作用HeLa细胞6 h后,同样可以调节以上蛋白质的表达,充分说明桦木酸可有效抑制PI3K/Akt信号通路,并影响下游细胞周期及线粒体途径。4.桦木酸作用HeLa细胞后可显著降低分裂期(S期)的细胞数量,将细胞周期阻滞在DNA合成前期(G0/G1)期,与细胞周期抑制蛋白p27Kip、p21Waf1/cip1受桦木酸调控活化相呼应。5.线粒体膜电位在桦木酸作用HeLa细胞1 h后显著下降,且线粒体膜通透性相关蛋白Bc1-x1和Bad的表达比值在桦木酸作用下也显著下调,同时桦木酸上调了caspase-9蛋白表达,表明线粒体介导的凋亡途径被桦木酸激活。6.桦木酸处理HeLa细胞0.5 h后活性氧水平显著升高,并呈现时间和剂量依赖性。利用谷胱甘肽抑制活性氧后,桦木酸对PI3K/Akt途径的抑制减弱,证实了活性氧是桦木酸抑制PI3K/Akt的上游因子,同时发现桦木酸诱导的细胞凋亡现象,及细胞周期途径、线粒体凋亡途径均依赖于活性氧的产生,表明活性氧是桦木酸抑制HeLa细胞增殖且诱导其凋亡的关键因子。