目的:组蛋白去甲基化酶LSD1是重要的抗肿瘤靶点之一,并在多种肺癌细胞中高表达。本研究利用课题组构建的LSD1体外酶活性筛选平台,对三十余种中药提取物和含有近千种化合物的天然产物库进行了LSD1抑制活性筛选,并对具有LSD1抑制活性的中药及单体在重组蛋白水平和细胞水平进行抗肺癌活性评价。本研究有望发现结构新颖、活性优异的天然小分子LSD1抑制剂和对LSD1具有抑制作用的中药提取物,为新型LSD1抑制剂的开发提供先导结构,同时为基于表观遗传的中药抗肺癌研究提供新思路。方法:1.构建体外LSD1抑制剂筛选平台利用LSD1原核表达载体,进行原核表达并纯化得到LSD1重组蛋白。基于LSD1催化底物去甲基化过程中能够产生过氧化氢的原理,利用Amplex Red荧光法检测过氧化氢生成量,以反映LSD1活性。2.天然产物库与中药文库的LSD1活性筛选利用上述筛选平台对天然产物库和课题组的中药提取物进行活性筛选。通过Western blot检测活性单体和中药提取物在细胞水平对LSD1活性的影响,验证其能否在细胞水平抑制LSD1的活性。3.活性单体与LSD1结合模式预测根据活性单体的分子结构特征,选择LSD1与小分子复合物的共晶结构,通过分子对接探讨天然单体与LSD1活性位点的作用模式,找出关键的氨基酸残基结合位点,为进一步结构优化获得活性更好的LSD1抑制剂打下基础。4.体外抗肺癌细胞活性评价采用MTT法与克隆形成法检测活性单体和中药提取物对四种肺癌细胞株H1299、H460、H1975和A549增殖活性的抑制作用。通过划痕实验、Transwell与Western Blot等方法检测LSD1抑制剂对肺癌细胞株侵袭及迁移能力的影响。利用流式细胞术、免疫荧光和Western Blot方法等检测LSD1抑制剂对肺癌细胞凋亡过程的影响。结果:1.基于天然产物与中药文库筛选LSD1抑制剂在10μM浓度下对天然产物库进行初步筛选,发现血根碱的活性较好,IC50值为0.4μM。在100μg/m L浓度下对32种中药提取物进行初筛,发现8种中药提取物对LSD1酶活性的抑制率达到85%以上。对这8种中药提取物进行肺癌细胞活性筛选,发现葛根提取物同时具有良好的抑制细胞增殖与LSD1酶活性的能力。2.分子对接模拟血根碱与LSD1结合通过分子对接初步探讨血根碱与LSD1的作用模式,预测结果表明血根碱能够顺利进入LSD1活性口袋,与氨基酸残基之间形成的π-π堆积作用以及氢键作用来稳定结合构象,并且多环共轭体系能够与FAD尾部部分重叠,可能与FAD竞争进入活性位点。3.血根碱与葛根提取物抑制LSD1活性Western Blot法检测活性中药提取物或单体在细胞水平对LSD1活性的影响。结果显示,血根碱能够显著改变LSD1特异性底物（H3K4me2和H3K9me2）及CD86的表达水平,表明血根碱在细胞水平抑制LSD1活性。而葛根提取物可能是通过降低LSD1的表达量来提高其特异性底物H3K4me2和H3K9me2的表达水平,其具体作用机制有待进一步探索。4.血根碱与葛根提取物抑制肺癌细胞的增殖、转移与侵袭MTT与克隆形成实验的结果表明,血根碱和葛根对四种肺癌细胞H1299、H460、H1975和A549均有显著的增殖抑制活性(血根碱的IC50值为1.45-2.85μM;葛根的IC50值为1.16-9.6 mg/m L)。另外,划痕实验、Transwell、DAPI染色、Western Blot和流式实验结果表明,血根碱和葛根能够抑制肺癌细胞的侵袭、转移、EMT过程,并诱导肺癌细胞凋亡。结论:本课题利用基于荧光的LSD1抑制剂筛选平台,对已有中药文库和天然单体库进行筛选,发现血根碱和葛根提取物对LSD1具有良好的抑制活性,同时在细胞水平验证了二者对LSD1的抑制作用。体外抗肺癌细胞活性实验表明,血根碱和葛根提取物均能有效抑制肺癌细胞增殖、转移与侵袭,并诱导肿瘤细胞凋亡,这些结果为新型LSD1抑制剂的发现以及中药抗肿瘤研究提供新思路。