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随着消费者对健康饮食的需求,植物多酚抗氧化剂在肉制品中应用日益广泛;多酚抗氧化过程中与蛋白形成加合物,这些加合物从蛋白结构、凝胶性能以及营养与安全等方面影响着肉制品的品质;目前对加合物的形成机制及其对肉品品质影响机理尚不明确。因此本课题的研究目的主要包括:对肉制品中多酚-蛋白加合物的形成机制进行深入研究,并从蛋白结构、凝胶性能、抗氧化性、细胞毒性、细胞周期及细胞凋亡等方面分析其对肉制品功能特性与营养安全的影响机制,最终为多酚类抗氧化剂在肉制品工业生产中得到安全有效地应用、提高肉制品品质,提供强有力的理论支持。首先研究了迷迭香酸(RosA)与巯基化合物的加合反应。RosA与Cys、GSH、Peptides、肌球蛋白在氧化(0.1 mMFeSO4,30 mM H2O2)条件下形成的加合产物,.通过UPLC-LTQ-Orbitrap及MALDI-TOF/TOF质谱技术进行结构鉴定;研究了反应时间、反应温度及氧化强度等加工因素对加合产物形成规律的影响。研究结果显示:(1)RosA与Cys在氧化条件下形成两种加合产物:Cys-RosA、Cys-RosA-Cys,前者的加合位点发生在巯基与RosA右侧苯环,后者的加合位点分别位于RosA两侧苯环;RosA与GSH在氧化条件下形成一种加合产物:GSH-RosA,加合位点同样在RosA右侧苯环;RosA与多肽中半胱氛酸侧链上的巯基分别形成加合物:P1-RosA,P2-RosA及P3-RosA。(2)鉴定了肌球蛋白与RosA的加合肽段m/z= 1425.73,确认碎片离子的肽序列为LEDEC*SELK,并且证明了肌球蛋白与RosA之间的加合位点为Cys949。首次确定RosA与肌球蛋白之间的准确加合位点,并且证明在肉类储存和加工过程中植物多酚提取物与肌原纤维蛋白之间存在加合反应。(3)随着反应时间(1-7 h)的增加,加合物Cys-RosA呈现显著上升趋势,GSH-RosA增长不明显,说明Cys相比于GSH更具反应活性;随着反应温度(30-50℃)的升高,加合物Cys-RosA与GSH-RosA均显著增加;随着氧化强度(10-70 mM H2O2)的升高,GSH-RosA呈现显著上升,而Cys-RosA先上升然后出现明显下降。其次基于蛋白组学方法对迷迭香酸与猪肉蛋白加合反应进行研究。RosA与猪肉蛋白4℃下在Fenton氧化模型(10 μm FeCl3,100 μm抗坏血酸和1 mM H2O2)中反应12 h,通过Triple TOF MS/MS质谱技术对迷迭香酸修饰的蛋白及其修饰位点进行全面分析鉴定,并对不同氨基酸修饰位点、蛋白中修饰位点的数量等进行定量分析,揭示多酚对猪肉蛋白加合修饰的规律。主要研究结果如下:(1)迷迭香酸化蛋白质组的鉴定结果显示,67个蛋白质发生迷迭香酸修饰,共检测到75个RosA修饰的多肽。通过分析发现这些蛋白质在广泛分布在肌原纤维蛋白、肌浆蛋白及跨膜蛋白中,不仅影响肉制品凝胶性能,而且参与了多种生物代谢途径,如糖酵解、嘌呤代谢等。(2)对75个RosA修饰的多肤进行分析,8个含有Cys的肤,14个含有His的肤,48个含有Arg的肽,64个含有Lys的肽和5个含有N末端的肽。对加合蛋白的77个加合位点进行分析,包括2个N-末端加合位点,3个Cys加合位点,4个His加合位点,29个Arg加合位点和39个Lys加合位点。(3)蛋白修饰位点分析显示大约80.597%的蛋白质携带单个RosA修饰位点,14.925%携带两个修饰位点,1.492%包含三个修饰位点,并且其余2.985%具有四个或更多修饰位点。随后研究了迷迭香酸与肌原纤维蛋白的加合物对凝胶品质的影响机制。本章研究以典型肉制品加工盐浓度(0.6mol/LNaCl)条件下,氧化模型(10μmol/LFeC13,100μmol/L 抗坏血酸,1mmol/LH2O2,pH6.25)中不同浓度(0,0.05,0.25 和 1.25 mM)的迷迭香酸(RosA)对猪肌原纤维蛋白(MP)进行处理,通过流变特性、蛋白二级结构、持水力、凝胶强度等方面考察蛋白凝胶性能的变化,结合UPLC-Q-TOFMS/MS质谱技术对加合产物进行定量分析,首次从分子角度阐明了多酚-蛋白加合产物的形成规律及其对凝胶性能的影响机制。主要研究结果如下:(1)随着RosA浓度的增加,α-螺旋和β-折叠显著减少(P<0.05),而β转角和无规卷曲显著增加(P<0.05);中低浓度(0.05和0.25 mM)的RosA几乎不影响蒸煮损失,而用高浓度(1.25 mM)RosA处理的样品的蒸煮损失增加超过35%;中低浓度(0.05和0.25 mM)的RosA对凝胶强度影响不大,而高浓度(1.25 mM)RosA处理的样品凝胶强度显著降低;加入0.05 mM RosA不影响凝胶白度,而0.25 mM的RosA对凝胶白度显著影响(P<0.05),1.25 mM RosA与0.25 Mm RosA凝胶白度进一步显著降低(P<0.05)。(2)根据迈克尔加合反应预测多种水解产物,通过UPLC-Q-TOF MS/MS质谱法鉴定出了三种水解加合物,包括3,4-二羟基,5-N6-精氨酸肉桂酸、3,4-二羟基,5-N5-组氨基肉桂酸和3-(3,4-二羟基苯基,5-半胱氨酰-S-基)乳酸。(3)在中低浓度RosA(0.05,0.25 mM)的情况下,形成了 RosA-Cys和Arg/His-RosA-Cys加合物,后者对蛋白质凝胶性能产生积极作用。在高浓度的RosA(1.25 mM)的情况下,RosA-Cys成为主要的加合物并阻碍MP上的巯基形成二硫化物交联,从而破坏了蛋白质凝胶网络的形成,降低了凝胶强度和持水能力。(4)通过凝胶微观结构,观察发现中低浓度RosA(0.05 mM和0.25 mM)处理的样品具有较多的纤维细丝,蛋白之间形成良好的交联;而高浓度RosA(1.25 mM)样品中,大多数蛋白质变性为具有较少交联的球形、较粗糙的网络,形成较大的空隙,蛋白的凝胶结构遭到破坏。最后,研究了多酚-蛋白加合产物对细胞抗氧化相关酶类以及细胞周期与细胞凋亡的影响。模拟氧化体系下,迷迭香酸(RosA)与谷胱甘肽(GSH)反应48小时制备GSH-RosA加合物;用对照、氧化对照、RosA及GSH-RosA分别处理LO-2细胞系,研究其自由基清除能力(DPPH)、细胞毒性(MTT)、相关抗氧化物质(MDA,GSH)含量、抗氧化酶(SOD)活性、相关抗氧化酶(SOD1,CAT)的表达水平以及细胞周期与细胞凋亡,从而对加合物的抗氧化性及安全性进行有效评估。主要研究结论如下:(1)合成得到GSH-RosA并通过制备液相进行纯化,其体外抗氧化性介于GSH与RosA之间,随着浓度的增加RosA-GSH抗氧化性显著提高,150μM时达到RosA抗氧化性的90.04%。(2)RosA-GSH细胞抗氧化分析中,能够显著抑制MDA,72h时RosA与RosA-GSH两处理组中MDA含量则无明显差别;RosA-GSH处理细胞中GSH含量显著高于氧化对照组,但低于RosA处理组;RosA-GSH处理组中SOD活性72 h时显著上升至166.30 nmol/mg Pro.(P<0.05)。(3)免疫印迹实验发现,RosA-GSH处理组细胞中CAT,SOD1的表达水平显著高于氧化模型组(P<0.05)。72h时,CAT表达水平低于RosA处理组(P<0.05),而SOD1表达水平与RosA处理组无明显差异。(4)MTT细胞毒性实验中,RosA随着浓度的增加,对正常细胞表现为显著的抑制作用,RosA-GSH对正常细胞抑制作用则相对不明显。RosA在一定浓度下具有细胞毒性,而RosA-GSH即使在大剂量添加的情况下,仍具有高度的安全性。(5)细胞周期实验中,500μMRosA处理LO-2细胞24 h后G1期细胞比例从36.81%到增加62.41%,G2+M期细胞也减少(从23.90%到13.41%),细胞的S期也有所减少;而500 μM GSH-RosA处理对LO-2细胞周期的影响相对较小,与空白对照组相比,G1期细胞显著增多(P<0.01),S期细胞减少,而G2/M期细胞相对变化不明显。(6)细胞凋亡实验中,500 μM RosA处理24h的LO-2细胞样品与对照组相比,存活细胞百分比显著下降(P>0.05),凋亡细胞百分比显著上升(P>0.05)达到4.96%。而GSH-RosA处理组中LO-2的细胞增值的抑制作用明显低于RosA处理组并且细胞凋亡过程得到缓解。本研究结果显示:氧化条件下RosA与巯基化合物发生迈克尔加成反应,并且反应时间、反应温度及氧化强度等加工因素影响加合产物的形成;多酚对猪肉蛋白加合修饰具有一定的规律,多酚-蛋白加合产物的形成对肉制品凝胶性能造成影响;加合物GSH-RosA与RosA相比,具有类似的抗氧化效果并且对细胞毒性、细胞周期与细胞凋亡影响较小。这些研究结果为肉类工业中安全有效地应用多酚类抗氧化剂提供理论依据;同时,多酚-蛋白加合物影响凝胶性能的理论也启发了我们从分子水平调控肉制品功能与特性的研究思路。