普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)由于其专一催化水解支链淀粉中α-1,6-糖苷键的特性,被广泛地应用于葡萄糖工业生产中。在淀粉糖化过程中,将普鲁兰酶和糖化酶复合使用,可以增加葡萄糖的产量、提高葡萄糖的质量、节约成本和时间。本实验采用来自长野芽孢杆菌并且具有优良酶学性质的重组普鲁兰酶(PUL),通过对糖化产物的分析、糖化工艺的优化以及重组普鲁兰酶应用稳定性的研究,使其基本达到商品普鲁兰酶的效果,为其工业化生产和应用奠定了基础,不仅具有技术研究意义,也具有很高的经济意义。主要研究结果如下:麦芽糊精经普鲁兰酶和糖化酶协同作用水解后,糖化液中主要含有葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。其中,在糖化阶段葡萄糖含量(DX)先上升,糖化48 h后开始下降,而异麦芽糖含量(IM)则一直保持增长趋势,表明葡萄糖可以反向聚合生成异麦芽糖。在糖化酶添加量50 U·g–1干基麦芽糊精、糖化温度55°C、糖化p H值4.5和时间72 h的条件下,添加PUL(0.5 U·g–1干基麦芽糊精)的实验组DE和DX值明显高于对照组,而IM值则低于对照组。添加PUL的实验组DE值和添加OPTIMAX L-1000的实验组基本接近,而DX值则低于添加OPTIMAX L-1000的实验组,说明PUL的糖化效果和OPTIMAX L-1000存在一定差距。通过PUL和OPTIMAX L-1000的比较,确定了复合酶糖化中糖化酶和普鲁兰酶的最佳比例为50:1。然后,分析了不同麦芽糊精浓度(d.m.)对复合酶糖化DX值、IM值以及时空产率的影响,将最佳的麦芽糊精浓度定为20%,此时,最高DX值98.87%、时空产率5.49 mg·g–1·h–1,均维持在较高水平。通过单因素试验、正交试验和响应面试验确定了复合酶糖化麦芽糊精的最佳工艺参数:糖化温度55°C、p H值4.5、复合酶添加量75 U·g–1以及糖化时间36 h,在此条件下糖化液的实际DX值为99.35%。研究了不同物质对普鲁兰酶热稳定性的影响,结果表明,明胶、甘油、Tween 20和Ca2+四种保护剂能显著提高PUL的热稳定性。结合单因素试验,并通过正交试验得到了最佳的复合保护剂配方,即Tween 20 2 m L·L–1,明胶6 g·L–1,甘油5%,Ca2+0.1 mol·L–1。在此条件下,40°C保温48 h后,酶活保留率为94.68%。并考察了复合保护剂对PUL热稳定性的影响,在55°C下,未加保护剂的PUL的半衰期是11 h,而加入特定的保护剂后,半衰期为47 h,提高了3.27倍。然后研究了复合保护剂对复合酶糖化的影响,加入复合保护剂后,葡萄糖整体含量上升,而异麦芽糖整体水平在下降,说明PUL在复合保护剂的作用下,热稳定性得到了增强。在液体酶中添加防腐剂(0.1%山梨酸钾和0.1%苯甲酸钠)能有效抑制酶液中杂菌污染,提高酶液的储存稳定性。最终在25°C保藏90 d后,含有复合保护剂和防腐剂的PUL酶活保留率高达85.25%,满足了工业的需求。