目的： [1]以密码子优化的人乳头瘤病毒(HPV)6b结构蛋白L1△为载体携带沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白多表位(MOMP168)，克隆HPV6bL1△/CtMOMP168的嵌合基因。并通过pcDNA3.1(+)真核表达载体构建了重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168，即人乳头瘤病毒与沙眼衣原体嵌合DNA疫苗。将重组质粒转染COS-7细胞，筛选重组表达质粒，并经SDS-PAGE电泳和Westernblot分析证实目的蛋白。 [2]提取pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168重组质粒，溶于PBSbuffer并免疫BALB/C小鼠，同时设置对照组。研究pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168重组质粒的免疫效应。 [3]以pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168和pET32a/CtMOMP168蛋白联合免疫对小鼠的免疫效应，探讨“Prime-boost”免疫方案的最佳免疫策略。 [4]所有动物0w，2w，4w免疫。途径：DNA采用小鼠股四头肌注射免疫，蛋白采用背部多点注射。初免后0，1，3，5，7w小鼠尾静脉取血，检测其体液免疫效应，同时取小鼠阴道分泌物，检测局部黏膜的sIgA的产生。并于小鼠初兔后第8周，每组处死3只小鼠，取脾淋巴细胞检测其CTL细胞杀伤活性和胞内细胞因子IFN-γ，IL-4，IL-10的分泌。 方法： [1]设计了扩增HPV6bL1△的PCR引物，并在两端设计酶切位点。同时将质粒pET32a/HPV6bL1/CtMOMP168用相同的酶进行酶切，通过基因克隆方法将HPV6bL1△的PCR片段定向插入到原核表达载体pET32a/HPV6bL1/CtMOMP168中，以置换HPV6bL1片段，构建成重组表达质粒pET32a(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168；再将前者中的HPV6bL1△/CtMOMP168经酶切连接到真核表达质粒pcDNA3.1(+)，最终构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168。测序分析进行鉴定。用Polyfect脂质体转染试剂盒将经鉴定的重组质粒转染至COS-7细胞，通过SDS-PAGE电泳和Westernblot分析鉴定表达的重组质粒。 [2]大量提取pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/ctMOMP168重组质粒，溶于PBSbuffer并免疫BALB/C小鼠，150ug/100ul/只，同时设置同时设置①pcDNA3.0/HPV6bL1△，②pcDNA3.0/HPV6bL1③pcDNA3.1(+)/CtMOMP168，④pcDNA3.0/HPV6b1△+pcDNA3.1(+)/CtMOMP168⑤pcDNA3.1和⑥PBSbuffer等六组作为对照。共7组，每组7只小鼠。于0w，2w，4w小鼠股四头肌免疫。所有小鼠免疫前均采用利多卡因局部注射。以使肌肉松弛，便于质粒的吸收。 [3]核酸和蛋白联合免疫方案“Prime-boost”。具体分3组：①pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168首次0周免疫，pET32a/CtMOMP168蛋白2、4周加强免疫两次；②pET32a/CtMOMP168蛋白首次0周免疫，pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP1682、4周加强免疫两次：③pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168和pET32a/CtMOMP168蛋白同时0、2、4周免疫3次。 [4]初免后0，1，3，5，7周小鼠尾静脉取血，分离血清，检测其特异性抗HPV6bL1，pET32a/CtMOMP168和抗Ct全菌体的抗体，同时用100ulPBSbuffer冲洗小鼠阴道，检测局部黏膜sIgA的产生。并于小鼠初免后第8周，每组处死3只，取脾淋巴细胞检测其CTL细胞的杀伤活性和胞内细胞因子IFN-γ,，IL-4，IL-10的分泌情况。 结果： [l]经酶切和测序鉴定，获得了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168。转染哺乳细胞COS-7后，通过SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定，在真核细胞内成功表达了分子量约为60KDa的嵌合蛋白。 [2]动物免疫后检测各组小鼠体液免疫和细胞免疫效应，ELISA结果显示核酸免疫后pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168组，能产生对pET32a/CtMOMP168的特异性IgG和sIgA，也能产生对HPV6bL1和Ct全菌体的特异性IgG。CTL细胞活性检测结果显示小鼠核酸免疫后能产生对靶细胞的特异性杀伤作用，FCM检测胞内细胞因子结果显示，免疫后小鼠脾淋巴细胞能够产生较高的IFN-γ，产生IL-4和IL-10则相对较低。 [3]核酸和蛋白联合免疫方案“Prime-boost”：通过检测以上指标并相互比较，显示①pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168首次0周免疫，pET32a/CtMOMP168蛋白2、4周加强免疫两次和③pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168和pET32a/CtMOMP168蛋白同时0、2、4周免疫3次两种方案相对于②pET32a/CtMOMP168首次0周免疫，pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP1682、4周加强免疫两次更能刺激小鼠产生有效的免疫反应。三种免疫方案中，以①③为佳。 结论： [1]成功构建了嵌合基因真核表达质粒，并在哺乳细胞中表达了嵌合蛋白。为研究HPV-Ct嵌合疫苗的免疫保护效应提供实验基础。 [2]pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168免疫小鼠后，能刺激其产生全身的体液免疫和细胞免疫效应，及粘膜局部的体液免疫反应。 [3]核酸和蛋白联合免疫方案“Prime-boost”中，以①pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168首次0周免疫，pET32a/CtMOMP168蛋白2、4周加强免疫两次和③pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168和pET32a/CtMOMP168蛋白同时0、2、4周免疫3次两种方案更能有效刺激小鼠产生免疫反应。