第一部分山东省产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌流行病学调查[研究背景]β-内酰胺类抗生素被广泛应用于各类感染的治疗,如肺部感染、尿路感染以及血流感染等,而且常用于术前预防用药。由于其具有杀菌作用强,抗菌谱广和副作用小等特点成为人类抵御细菌感染的临床一线用药。然而,随着β-内酰胺类抗生素的广泛应用,细菌对β-内酰胺类抗生素耐药性问题日趋严重,尤其是肠杆菌科细菌。产超广谱β-内酰胺酶(Extended-specturm β-lactamases, ESBLs)是其耐药的主要机制。基于诸多文献对ESBLs的研究和定义,ESBLs主要指由革兰阴性菌产生的,可水解灭活青霉素类、头孢菌素和单环酰胺类抗生素的β-内酰胺酶,但其活性可被舒巴坦、克拉维酸和他巴唑坦等β-内酰胺酶抑制剂所抑制。因其水解底物比广谱β-内酰胺酶(TEM-1、SHV-1和TEM-2)广泛,所以称其为超广谱β-内酰胺酶。目前,世界各地已经发现数百种ESBLs,主要流行的基因型有TEM、SHV、 CTX-M和OXA等,各地流行的ESBLs基因型存在较大差异,但是总的来说其流行特点有以下几点：(1)大部分地区流行的基因型型主要来源于TEM-1、TEM-2和SHV-1基因的点突变导致的氨基酸顺序改变；(2)不同地区流行的基因型不同,同一地区可检出多种基因型和基因亚型；(3)近年,CTX-M基因型在世界各地迅速蔓延,并不断有新的基因亚型检出,它们与TEM型和SHV型ESBLs不同,各亚型间核苷酸序列同源性较低；(4)不同基因型抗药活性不同,TEM和SHV型对头孢他啶水解活性强,而CTX-M型对头孢噻肟的水解活性明显高于头孢他啶；(5)产ESBls菌株常常是多重耐药菌株(multi-drug resistant bacteria,MDR)。不同地区和国家ESBLs的流行基因型和耐药特点不同,诸多国家对当地ESBLs流行情况进行了大量研究,特别是欧洲国家。尽管如此,国内尚缺少系统性研究,特别是山东地区尚无产ESBLs大肠埃希菌流行病学研究资料,对当地ESBLs流行的基因型和细菌耐药情况资料缺乏,此研究基于山东样本,不仅完善了我国北方地区产ESBLs大肠埃希菌的分子流行病学资料,揭示了其耐药性特点,为明确本地区ESBLs流行特点和指导临床治疗提供了重要科学依据。我们于2010年7月到2014年8月期间在山东省三家大型医院(患者来自于全省各地)的微生物实验室培养分离的临床标本中共收集到578株大肠埃希菌。对ESBLs产生情况、以及它们的耐药性及其基因型进行了分析。明确大肠埃希菌产ESBLs的主要基因型和耐药情况,为指导临床抗感染治疗提供实验室证据,提高经验治疗的有效性,减轻病人的负担。[研究目的]1.调查山东省产ESBLs大肠埃希菌的流行情况。2.研究分析产ESBLs大肠埃希菌的耐药性,指导临床合理应用抗生素,提高感染性疾病治疗效果。3.对产ESBLs的大肠埃希菌中的p-内酰胺酶进行基因分型,明确本地区基因型流行情况。[材料与方法]1.收集三家大医院临床标本分离的大肠埃希菌(标本主要来自住院患者,患者来自全省各地),共578株,采用Micro scan VITEK-2全自动微生物分析仪,对菌株进行重新鉴定。2.用KB纸片圆盘法检测大肠埃希菌对23种抗生素的耐药性。3.经ESBLs初步筛选试验和表型确认试验筛选出产ESBLs的菌株。根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Labo ratoy Standard Institute, CLSI) 2013年的指导标准进行检测。4.设计TEM、SHV、CTX-M的引物,利用PCR技术对产ESBLs菌株扩增。5.对扩增产物进行纯化,然后进行测序分析,用BLAST对比工具进行比对,为美国NCBI在线工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。[研究结果]1.菌株来源：(1)菌株主要取自泌尿内科和ICU病房。其中从泌尿内科收集到220株大肠埃希菌,有148株(67.27%)产ESBLs菌株；ICU病房收集到128株,其中108株(84.38%)为产ESBLs菌株：(2)标本来源以尿液为主,共收集到252株大肠埃希菌；其次是创面分泌物(84株)、痰液(76株)、生殖道分泌物(56株)、胸水和腹水(52株)、血液(40株)和胆汁(18株)。2.耐药情况：(1)360株被确证为产ESBLs的耐药菌株,四年平均检出率达62.28%,每年检出率有差异,呈逐年上升的趋势；(2)大肠埃希菌对头孢菌素、喹诺酮类、氨基糖苷类等抗生素耐药率呈逐年上升的趋势；(3)产ESBLs菌株中多重耐药菌株多见,不仅对β-内酰胺类抗生素耐药,还对其他一线用药(如喹诺酮类、四环素类以及氨基糖苷类等)也耐药；(4)产ESBLs菌株比非产ESBLs菌株表现出更强的抗药性：环丙沙星产ESBLs组耐药率为79.4%,非产ESBLs组耐药率为49.5%(P<0.05),庆大霉素(73.6%：39.9%,P<0.05),复方新诺明(81.7%：54.6%,P<0.05),氨曲南(81.4%：15.1%,P<0.05),左氧氟沙星(91.9%：59.2%,P<0.05)。大多数菌株对阿米卡星敏感(敏感率产ESBLs组：非产ESBLs组为89.4%：96.3%,P<0.05),所有菌株均对亚胺培南和美罗培南敏感。3.基因型：(1)360株产ESBLs菌株中有303株产CTX-M型β-内酰胺酶,159株产SHV型β-内酰胺酶,有254株产TEM型β-内酰胺酶；(2)大多数菌株产两种及以上基因类型的β-内酰胺酶;(3)TEM型基因型测序分析发现TEM-1型β-内酰胺酶占绝大部分,仅发现12株TEM-135型超广谱β-内酰胺酶；SHV型基因测序分析发现SHV-12和SHV-2a型超广谱β内酰胺酶；CTX-M型基因测序分析发现主要为CTX-M-14型和CTX-M-15型,还发现少量CTX-M-3, CTX-M-98, CTX-M-142, CTX-M-65, CTX-M-55, CTX-M-27,和CTX-M-123型超广谱p-内酰胺酶。除此之外我们还发现8株TEM型基因序列位点发生突变,可能是新的TEM基因亚型,与TEM-135有99%同源性,我们需经进一步试验,检测这一基因的分子生物学特点。[研究结论]1.样本产ESBLs大肠埃希菌检出率较高,达到62.28%,且呈逐年上升的趋势,应提高对耐药菌管理的重视程度。2.产ESBLs的大肠埃希菌,主要基因型为CTX-M型,其次为TEM型。大多数菌株携带两种及以上基因型。3.DNA序列结果分析显示大肠埃希菌产β-内酰胺酶主要酶型为TEM-1、CTX-M-14和SHV-12。4. 产ESBLs大肠埃希菌多为MDR,不仅对头孢等β-内酰胺酶类耐药,而且对喹诺酮类和氨基糖苷类等抗生素耐药。因此,在临床治疗上应该慎重选择抗生素。5.未发现碳青霉烯类(亚胺培南和美罗培南)耐药菌株,头霉素(头孢西丁)和β-内酰胺酶类/β-内酰胺酶抑制剂复合物(哌拉西林/他唑巴坦)耐药率较低。对于轻度感染可以选用头霉素或β-内酰胺酶类/β-内酰胺酶抑制剂复合物抗感染治疗,而对于严重感染或危重患者适合选用碳青霉烯酶类抗生素治疗。第二部分产超广谱p-内酰胺酶大肠埃希菌感染危险因素分析[研究背景]产超广谱p-内酰胺酶大肠埃希菌是社区和医院感染的主要病原菌之一,在临床上有很高的分离率。其耐药基因常由质粒介导,不仅可以把耐药基因传给子代,也可以通过水平传播把耐药基因传给其他细菌,所以容易导致社区和医院感染的爆发流行。基于此点,各地对ESBLs的研究成为热点,除了研究其耐药机制,其感染的危险因素也是研究的焦点。近年来的研究发现ESBLs的检出率在世界各地区增长趋势较快。有些地区耐药菌株的检出率已经达到很高的水平。在欧洲,SMART分析2009-2010年尿路感染的菌株中发现ESBLs在大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌的检出率分别为17.6%和38.9%,在美国这一比率为8.5%和8.8%,新西兰地区产ESBLs在大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌中检出率为5%和0%,而在中国却达到67%和61%。在中国抗生素使用较频繁,一方面是管理相对比较松,另一方面是人们已经习惯应用抗生素来对抗疾病。通过研究本地区社区和院内产ESBLs大肠埃希菌流行情况,可以提高人们的预防意识,引起有关管理部门的重视,对相关政策的制定具有指导意义。基于医疗人员对广谱抗菌药物的青睐,特别是头孢菌素的不合理应用,耐药菌迅猛增加。研究人员发现入院前是否使用抗生素是社区和院内ESBLs流行和感染与独立危险因素,特别是第三代头孢的使用。除此之外,诸多研究发现院内感染的危险因素还包括：侵入性操作、入住ICU、手术等。由于人群差异性和医疗环境的不同,诸多文献对ESBLs感染的危险因素描述也不同。我们通过对本地产ESBLs大肠埃希菌感染的危险因素进行分析,弥补了省内此类研究的空缺,明确ESBLs感染的危险因素,针对性的采取相应的措施,为控制ESBLs在社区和院内传播感染有重要意义。产ESBLs大肠埃希菌所致的感染,是临床治疗的的难点。因为ESBLs耐药基因常由质粒介导,质粒常携带其他耐药基因,对常用药物喹诺酮类、氨基糖苷类和大环内酯类等一线药物耐药率较高,使临床医生常常在选择抗生素上陷入困境,选择广谱抗生素容易导致细菌耐药的传播,选择窄谱抗生素可能对感染无效,常导致经验治疗的失败。如严重血流感染的患者,如果是耐药菌的感染,如果用无效的抗生素治疗可能是致命的。许多研究表明,不合适的经验治疗是导致治疗失败的重要原因。然而许多时候明确的诊断结果需要较长时间,这就需要医生经验用药,所以当地的流行病学资料非常重要。本研究收集齐鲁医院社区和院内获得ESBLs大肠埃希菌血流感染病例318例,分析其流行情况;探究其感染的危险因素,可以针对性的提出有效的措施来减少ESBLs的产生和传播；了解患者治疗和转归情况,对指导临床医生经验性选择抗生素有重要帮助。[研究目的]本部分通过对大肠埃希菌血流感染病人的资料回顾性研究分析,明确ESBLs在社区和院内感染的发生率,及评估感染的相关危险因素,指导临床实施恰当的感染控制措施,为国家制定抗生素使用政策提供依据。评价各药物对ESBLs感染临床疗效,并指导临床合理应用抗生素,减少死亡率。[材料与方法]收集山东大学齐鲁医院2005年12月至2015年12月大肠埃希菌血培养阳性的病例共318例,统计患者的年龄、性别、所住病房、用药情况、基础疾病、临床转归情况等,并对患者的临床资料进行回顾性分析。调查产ESBLs大肠埃希菌在社区和院内感染各自的检出率；分别对社区和院内感染产ESBLs大肠埃希菌的危险因素进行分析。统计各患者抗感染治疗情况,对临床转归作出评价,分析各药物临床疗效。采用SPSS22.0软件进行数据处理和统计分析,统计方法主要为χ2检验、T检验和Logistic Regression分析,设P<0.05有统计学意义。[研究结果]1.人口学分布特征318份大肠埃希菌血培养阳性的病例中,包括202例产ESBLs大肠埃希菌培养阳性患者和116份非产ESBLs大肠埃希菌培养阳性患者。1.1年龄和性别分布男性140例(44%),女性178例(60%)；其中15至60岁154例(48.43%),60岁以上164例(51.57%)；平均年龄为59.78±17.82岁,男性的平均年龄为58.57±18.07岁,女性的平均年龄为60.72±17.04岁。1.2科室分布所收集患者资料主要来自泌尿科58例(18.24%)、内分泌48(15.09%)、ICU40例(12.59%)和老年保健病房37(11.64%)。各病房产ESBLs大肠埃希菌的检出率都较高,平均为63.5%(202/318),其中以ICU病房ESBLs检出率最高为82.5%(33/40)。1.3医院感染的发病率在本研究的318例病人中,医院感染共104例(104/318,32.7%),社区感染214例(214/318,67.3%)。其中医院感染病例中产ESBLs大肠埃希菌74(74/104,71.2%),社区感染产ESBLs大肠埃希菌128例(128/214,59.8%),医院感染与社区感染ESBLs检出率比较,71.2%vs59.8%,P<0.05,有显著差异。2.产ESBLs大肠埃希菌感染危险因素的分析2.1社区感染ESBLs大肠埃希菌危险因素分析社区感染ESBLs大肠埃希菌者共214例,其中产ESBLs大肠埃希菌病例数为128例(59.8%),对患者年龄、性别、基础疾病、应用药物等因素应用卡方检验单因素分析,发现有2个因素：三个月内住院史和三月内抗生素使用与感染产ESBLs大肠埃希菌显著相关。通过对单因素中的危险因素进行多因素Logistic回归分析发现,三个月内住院史(P=0.001, OR=5.272,95%CI:2.072-13.415)和三月内抗生素使用(P=0.001, OR=5.957,95%CI:2.187-16.227)为独立危险因素。2.2院内产ESBLs大肠埃希菌引发感染危险因素分析单因素分析发现：入住ICU (P=0.021, OR5.185)、引流管(P=0.035,OR2.605)和应用头孢菌素(P=0.024,OR2.949)这三个因素是危险因素。多因素Logistic回归分析发现：应用头孢菌素(P=0.036, OR2.944,95% CI:1.075-8.067)是产ESBLs的独立危险因素。3.治疗情况和转归3.1治疗情况大多数病例在细菌培养结果出来前,临床大夫已经选用抗生素治疗。经验性应用抗生素治疗274例(86.16%),药敏结果报告后,有179例(63.93%)经验治疗应用抗生素是敏感抗生素,剩余95例应用抗生素为耐药或中介药物。根据药敏结果,调整用药86例,有9例患者未及时调整用药。44例未经验用药的病例有38例是根据药敏结果选择合适抗生素治疗。仍有6例未用任何抗生素。3.2转归情况3.2.1经验治疗ESBLs组好转94例,非ESBLs组好转85例,两者有显著差异(94/174 vs 85/100,P=0.000)。最终死亡患者ESBLs组45例,非ESBLs组25例,两者无显著差异(45/202 vs 25/116, p=0.881)。分析结果说明对于非ESBLs感染组,经验治疗效果较好,而ESBLs组经验治疗失败率高。然而,根据药敏结果选择合适抗生素治疗后的最终治疗结果和死亡率两组无明显差异。及早根据药敏结果选择合适的抗生素是治疗产ESBLs菌株感染的关键。3.2.2所有患者平均住院时间为18.54±11.00天,产ESBLs组为19.86±12.41天,非产ESBLs组为16.25±7.45天。两者住院时间T检验计算P值为0.003,有显著差异。转归：治疗失败70例,其中用碳青霉烯类治疗失败3例(3/48),β内酰胺酶抑制剂复合制剂8例(8/79),三代头孢21例(21/50),喹诺酮类11(11/72),起始抗感染治疗21(21/44)。应用头孢菌素治疗死亡率要比应用其他药物治疗死亡率高,统计学有显著差异(21/50 vs 28/224, P=0.000),碳青霉烯类抗生素治疗比应用头孢类药物治疗死亡率低,统计学有显著差异(3/48 vs45/226,P=0.024)。3.2.3在2005年12月至2014年12月期间,我们未发现对亚胺培南和美罗培南耐药菌株；而从2014年12月至2015年12月期间,我们发现5株对亚胺培南和美罗培南耐药的大肠埃希菌,下一步我们将重点研究其分子生物学特点和耐药机制。[研究结论]1.社区感染产ESBLs大肠埃希菌感染的独立危险因素是三个月住院史和三个月内抗生素使用史。因此,我们在严格控制使用抗生素的同时,也应该采取其他必要的措施控制ESBLs的传播,如加强医院环境管理、接触隔离、器械消毒隔离和注意手部卫生等,这样可以有效减少ESBLs的产生和传播。2.院内感染产ESBLs大肠埃希菌感染的独立危险因素是头孢菌素的应用。在临床治疗上应该慎重选择抗生素,尽量根据药敏结果合理应用抗生素。3.临床治疗结果分析发现三代头孢菌素的使用可能增加患者的死亡率,而应用碳青霉烯类抗生素比应用其他抗生素死亡率低,因此对于严重感染患者首选碳青霉烯类抗生素,对于轻度感染患者可选用头霉素或者β-内酰胺酶类/β-内酰胺酶抑制剂复合物,并根据药敏报告及时作出调整。