【摘 要】
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目的:构建基于电渗泵的新型高效外泌体分离芯片技术,对提取到的外泌体进行表征验证;利用此技术提取NSCLC患者、肺良性病患者及健康体检者的血浆外泌体,检测分析各组ExoPD-L1的表达差异,探讨其在NSCLC诊断中的应用价值。方法:本实验纳入对象91例,包括NSCLC患者45例,肺良性病患者16例,健康体检者30例。1.运用纳米孔薄膜,构建基于电渗泵及凝胶电泳微流芯片的一体式外泌体分离芯片;采用该技
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目的:构建基于电渗泵的新型高效外泌体分离芯片技术,对提取到的外泌体进行表征验证;利用此技术提取NSCLC患者、肺良性病患者及健康体检者的血浆外泌体,检测分析各组ExoPD-L1的表达差异,探讨其在NSCLC诊断中的应用价值。方法:本实验纳入对象91例,包括NSCLC患者45例,肺良性病患者16例,健康体检者30例。1.运用纳米孔薄膜,构建基于电渗泵及凝胶电泳微流芯片的一体式外泌体分离芯片;采用该技术提取血浆外泌体;TEM技术表征外泌体的形貌特点;Nanosight技术检测外泌体的浓度及粒径分布;Western blot技术分析外泌体上标志蛋白HSP70、TSG101的表达情况。2.采用上述芯片提取研究对象的血浆外泌体,ELISA法检测提取到的外泌体表面PD-L1的表达量,比较其在NSCLC组、肺良性病组及健康对照组间的表达有无差异;分析ExoPD-L1的表达与NSCLC患者临床特征间的联系;以病理检查为金标准,比较血浆ExoPD-L1表达与“肺癌标志物5项”用于诊断NSCLC的差异。结果:1.成功构建基于电渗泵的外泌体分离芯片技术;TEM表征证实提取到的外泌体形态完整、呈“茶托”状、直径约100 nm;Nanosight表征说明提取产物中外泌体浓度约（1.13±0.08）×109/mL,直径集中于50-150 nm;Western blot检测到外泌体表面标志蛋白HSP70、TSG101的表达。2.以（中位数,四分位数间距）的形式对NSCLC组、肺良性病组、健康对照组的ExoPD-L1相对含量进行统计描述,分别为（15.77 pg/mL,16.76 pg/mL）、（8.37 pg/mL,3.13 pg/mL）、（5.54 pg/mL,5.65 pg/mL）。利用Kruskal-Wallis H检验分析,三组ExoPD-L1的含量具有差别（H=38.229,P<0.01）,NSCLC组ExoPD-L1的表达量明显高于其他两组。进一步行两两比较统计分析表明,NSCLC组的ExoPD-L1表达量对于肺良性病组间及健康对照组间均有差别（P<0.01）,但此差异表达现象并不存在于肺良性病组和健康对照组间（P>0.05）。3.NSCLC患者ExoPD-L1相对含量在肿瘤分期较高（T3/T4 vs.T1/T2,P=0.038）、有淋巴结浸润（N1/N2 vs.N0,P=0.003）、有远端器官转移（M1/M2 vs.M0,P=0.013）、临床分期较晚（Ⅲ/Ⅳ vs.Ⅰ/Ⅱ,P=0.003）者中明显增高;而ExoPD-L1表达水平与年龄、性别及吸烟无相关性（P>0.05）。4.以病理检查为金标准,利用ExoPD-L1表达水平检出NSCLC,进行ROC曲线的拟制,得出诊断界限为9.65 pg/mL（95%CI:0.823-0.961）,该方法的敏感度为77.8%,特异度为86.7%,P<0.01;ExoPD-L1检测及“肺癌标志物5项”检测分别对肺占位患者做出诊断,得出ExoPD-L1检测的敏感度为77.8%（35/45）,特异度为81.3%（13/16）;“肺癌标志物5项”检测的敏感度为46.7%（21/45）,特异度为87.5%（14/16）;与病理学检查结果作一致性检验,前者Kappa值为0.517,后者为0.237;二者进行配对卡方检验显示出对检出NSCLC的统计学差异,P<0.01。结论:1.构建的基于电渗泵的外泌体分离芯片技术能够从血浆样品中成功提取形态完整、功能完善的外泌体,可用于后续实验。2.NSCLC患者血浆ExoPD-L1表达浓度明显高于其他两组对照,且含量与其肿瘤分期、淋巴结浸润、远端器官转移及临床分期呈正相关;血浆ExoPD-L1检测相对于“肺癌标志物5项”检测,诊断NSCLC的敏感度、特异度较高,与病理学检查的一致性更好,具有较好的临床应用价值。
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