目的： 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor Necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)属于肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis factor，TNF)超家族新成员。TRAIL能快速、有效的诱导肿瘤细胞凋亡，而对大多数正常组织细胞没有毒性<[1]>。多药耐药(multidrug resistance，MDR)一直是肿瘤化疗的难题，也是急性白血病治疗失败的主要原因之一。近年来，国外一些学者研究发现，TRAIL对经化疗诱导后的实体瘤多药耐药细胞株作用优于其亲本细胞<[2]>，该实验结果为克服MDR找到了新思路，目前针对血液系统肿瘤细胞株研究的报道尚不多见。本实验研究TRAIL对阿霉素诱导的人慢性粒细胞白血病红白血病变耐药细胞株K562/A02(mdr-1<+>)的促凋亡作用及其机理，并联合凋亡诱导剂As<,2>O<,3>以观察其协同作用，为TRAIL作为一种新型的抗肿瘤生物制剂治疗多药耐药的急性白血病提供实验和理论依据。 方法： 1 细胞株培养及传代：人慢性粒细胞白血病红白血病变细胞株K562、人慢性粒细胞白血病红白血病变耐药细胞株K562/A02，中国医学科学院血液病研究所提供。细胞培养于含10％灭活胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml的RPMI1640培养液，5％CO2，饱和湿度，37℃的培养箱中，每2-3天传代一次，实验用对数生长期细胞。 2 K562及K562/A02细胞生物学检测 3 TRAIL诱导K562、K562/A02细胞凋亡 4 采用MTT法检测不同浓度TRAIL、As<,2>O<,3>单独及联合作用时对K562、K562/A02细胞的生长抑制作用。单药组分别加入终浓度为40、200、1000、2000、4000ng/ml的TRAIL和终浓度为1、2、5、10、25umol/L的As<,2>O<,3>；联合用药组分别加入终浓度为200、1000、2000、4000ng/ml的TRAIL，然后分别加入终浓度为2umol/L As<,2>O<,3>，实验方法同2．25采用RT-PCR方法检测K562、K562/A02细胞的NF-κB及TRAIL两种死亡受体DR4、DR5和诱骗受体DcR1、DcR2mRNA表达水平，方法同2.1。引物序列如下：NF-κB(RelA/P65)上游引物5-GTT CAC AGA CCT GGC ATCCGT-3，下游引物5-GAG AAG TCC ATG TCC GCAATG-3，扩增片段长度240bp；DR4上游引物5-CTG AGC AAC GCAGAC TCG CTG TCC AC-3，下游引物5-TCC AAG GACACG GCA GAG CCT GTG CCA T-3，扩增片段长度506bp；DR5上游引物5-GCC TCA TGG ACA ATG AGA TAA AGGTGG CT-3，下游引物5-CCAAAT CTC AAA GTA CGC ACAAAC GG-3，扩增片段长度502bp；DcR1上游引物5-GAAGAA TTT GGT GCC AAT GCC ACT G-3，下游引物5’-CTCTTG GAC TTG GCT GGG TTC ATG TCC TTC-3’，扩增片段长度612bp；DcR2上游引物5’-CTT TTC CGG CGG CGTTCA TGT CCT TC-3’，扩增片段长度453bp。 结果： 1 RT-PCR法检测K562、K562/A02两种细胞的mdr-1表达水平，K562/A02高表达mdr-1(1.87±0.05)，K562不表达。K562 IC<,50>=2.55±0.28，K562/A02 IC<,50>=105.06±10.65，耐药倍数=41.20>30倍，K562/A02可定为耐药细胞。 2 倒置显微镜下观察培养的K562、K562/A02细胞，在TRAIL作用下4小时时出现细胞体积变小、变形、细胞膜发泡等凋亡现象，11小时时部分细胞被裂解成数个大小不等的小体，同一时间观察K562/A02较K562细胞形态变化明显。光镜下观察到K562、K562/A02细胞在TRAIL作用24小时后细胞体积缩小，染色质凝聚附在核膜周边，嗜碱性增强，细胞核固缩呈均一的致密物，部分核碎裂，K562/A02较K562细胞形态变化明显。 3 流式细胞仪定量检测凋亡峰，发现K562、K562/A02细胞分别在各TRAIL浓度联合或不联合As<,2>O<,3>均发生细胞凋亡。200、1000、2000、4000ng/mlTRAIL单药作用下K562/A02组凋亡率逐渐增加，分别为19.33±0.13％，26.93±0.62％，34.93±0.10％，33.62±0.47％；K562组凋亡变化同K562/A02，分别为6.60±0.12％，8.26±0.03％，10.53±0.16％，9.87±0.07％，同一浓度下两组细胞间皆有统计学差别，K562/A02组凋亡作用优于K562组(p<0.05)。2umol/L As<,2>O<,3>单药作用下K562/A02、 K562组凋亡率分别为5.90±0.47％，3.57±0.06％，K562/A02组As<,2>O<,3>单药促凋亡作用优于K562组(p<0.05)。2000ng,mlTRAIL联合2umol/L As<,2>O<,3>作用下K562/A02、 K562组凋亡率分别为50.95±0.91％，20.75±0.95％， K562/A02组凋亡作用优于K562组(p<0.05)，两组均显示较单药凋亡率明显提高(p<0.05)，采用国内金(正均)氏公式<[3]>判断TRAIL和As<,2>O<,3>联合作用具有协同作用。 4 MTT分析细胞增殖抑制率：单用TRAIL在40-2000ng/ml剂量范围内，对K562、K562/A02细胞的增殖抑制作用具有剂量依赖性，TRAIL大于2000ng/ml以后继续增加剂量效果不增加，TRAIL对K562/A02的敏感性优于K562，200ng/ml组差异最显著(p<0.01)；单用As<,2>O<,3>对K562、K562/A02细胞的增殖抑制作用与TRAIL一致，K562/A02优于K562，有统计学意义(p<0.05)；经金(正均)氏公式判断TRAIL和As<,2>O<,3>联合作用协同性：结果显示K562、K562/A02细胞在200、1000、2000、4000ng/ml TRAIL和2umol/L As<,2>O<,3>联合应用后Q值分别介于单纯相加与增强之间(1.19～1.52)和(0.98～1.26)，提示TRAIL及As<,2>O<,3>在杀伤K562、K562/A02细胞时具有协同作用。 5 RT-PCR法检测K562、K562/A02两种细胞NF-κBmRNA的表达情况，表达水平分别为(9.90±0.09)，(10.13±0.02)，均有较高表达，两者无统计学意义的差别(p>0.05)；TRAIL的DR4mRNA表达水平分别为(1.01±0.01)，(1.81±0.03)，DR5mRNA表达水平分别为(1.18±0.04)，(4.22±0.06)，DR4、DR5在K562/A02中表达均高于K562，有统计学意义的差别(p<0.01)；DcRlmRNA表达水平分别为(0.25±0.01)， (0.05±0.03)，K562/A02较K562表达水平低，有统计学意义的差别(p<0.01)，DcR2在两种细胞中均不表达。 结论： 1 K562/A02高表达mdr-1，K562不表达，K562/A02的耐药倍数达30倍以上，可鉴定为多药耐药细胞。 2 TRAIL可诱导K562、K562/A02细胞凋亡，TRAIL、As<,2>O<,3>单药及两药联合对K562/A02促凋亡作用优于K562，联合作用优于单药。 3 As<,2>O<,3>对K562、K562/A02的敏感性与TRAIL一致。 4 在一定浓度范围内，TRAIL对肿瘤细胞K562、K562/A02的生长抑制呈剂量依赖性，TRAIL和As<,2>O<,3>联合作用于K562及K562/A02细胞，两药具有协同效应。 5 NF-κB在K562、K562/A02细胞中均有较高表达，K562/A02中DR4、DR5的表达高于K562，DcR1在K562/A02表达低于K562，受体表达的不同可能是K562/A02对TRAIL更敏感的原因。