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β-丙氨酸作为自然界中发现的唯一一种β型氨基酸,在医药、化工、食品、饲料等领域发挥着越来越重要的作用。生物法相比化学法制备β-丙氨酸具有反应条件温和、副产物少、转化率高、产物便于分离纯化、绿色环保等优点。L-天冬氨酸-α-脱羧酶可以催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸,是生物法制备β-丙氨酸的关键酶之一。原核来源的丙酮酰依赖型L-天冬氨酸-α-脱羧酶（PYR-Pan D）虽然热稳定性较好,但存在机理性失活,因此近年来真核来源的磷酸吡哆醛依赖型L-天冬氨酸-α-脱羧酶（PLP-ADC）越来越受关注,但该酶的热稳定性较差,限制了其在工业化生产β-丙氨酸中的应用。本论文选择了真核昆虫赤拟谷盗来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶（Tc ADC）进行分子改造,通过理性设计的策略提高其热稳定性。主要研究内容和结果如下:（1）根据序列共识突变和突变前后氨基酸残基解折叠自由能变化（ΔΔG）,分别使用Consensus Finder和Po PMu Si C两款软件找出并构建了28个能潜在提高Tc ADC热稳定性的单位点突变体。经过粗酶热稳定性的初步筛选,确定了5个突变位点的热稳定性有提高,分别为R87P、Q90E、V105L、S278A、A452E。亲和层析获得纯酶后,对它们的动力学参数和半衰期进行测定,结果显示,45℃的半衰期分别为264、288、204、252和216 min,野生型为132 min;50℃半衰期分别为30.8、30.2、22.1、21.3、23.3 min,野生型为14.8 min。R87P和Q90E的比酶活相比WT（5.59 U/mg）有提高,分别为5.98U/mg和5.92 U/mg;Km相比较野生型都低,表明突变体对底物的亲和力更强。通过分子动力学模拟（MD）,表明突变体R87P和Q90E整体刚性优于野生型,因此有更好的热稳定性;通过酶突变前后构象分析,发现R87P可能是增强了该loop环的刚性,导致蛋白质的结构刚性增加,从而使酶的热稳定性提高;Q90E由于形成了三个新的离子键,使该区域的α螺旋+loop+α螺旋的二级结构更加稳定,因此热稳定性有提高。（2）为了进一步提高该酶的热稳定性,以五个单点突变R87P、Q90E、V105L、S278A、A452为基础,通过迭代组合突变的策略,共构建了20个多位点突变体。综合考虑酶活和热稳定性,选择了双位点、三位点、四位点排名前二的突变体,进行半衰期和动力学参数的测定,分别为R87P/V105L、Q90E/A452E、R87P/V105L/A452E、Q90E/V105L/A452E、Q90E/V105L/S278A/A452E、R87P/V105L/S278A/A452E。结果显示,它们在45℃的半衰期分别为420、336、480、438、450和528 min;在50℃时的半衰期分别为39.0、32.9、47.8、43.2、46.3、51.3 min。因此热稳定性最好的是四位点突变体R87P/V105L/S278A/A452E(Tc ADCtb4),其在45℃的半衰期为野生型的4.0倍,也是最佳单位点突变体（Q90E）的1.8倍,这说明通过迭代组合突变可以在单位点突变的基础上进一步提高ADC酶的热稳定性。通过分子动力学模拟,发现Tc ADCtb4的局部柔性区域较野生型减少,整体刚性较野生型更强,因此有更好的热稳定性;通过蛋白质构象分析,发现V105L增强了该区域的疏水作用力,使α螺旋+loop+α螺旋二级结构变得更加稳定;S278A增强了该区域的疏水作用力,同时所形成的三个氢键使该区域的loop+α螺旋+loop的二级结构更加稳定;A452E新形成了一个离子键,使该区域α螺旋+β-折叠+loop的二级结构更加稳定。综上所示,这些作用力的叠加导致Tc ADCtb4展示出更好的稳定性。（3）通过整细胞生物催化合成β-丙氨酸的比较,发现相同条件下四位点突变体Tc ADCtb4转化率最高,因此更具有工业应用潜力。对Tc ADCtb4进行酶学性质表征,其比酶活为5.28 U/mg,Km为5.27 m M,kcat为0.26 s-1,Vmax为0.24μmol·min-1·mg-1。突变体和WT的最适温度和最适p H都为40℃和7.0;突变体具有比野生型更好的热稳定性和耐碱性环境,在p H 7.0-9.0时,突变体的残余酶活均高于野生型;同时该酶在Tris-HCl缓冲液体系具有更好的催化活性。