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γ-亚麻酸(γ-linolenic acid)是一种人体必需的多不饱和脂肪酸,它以其独特的生理机能日益引起人们的重视。微生物发酵生产γ-亚麻酸也成为国内外研究的热点之一。本文以雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegants)为研究对象,从菌种诱变方法、氮离子注入诱变选育高产菌株、发酵工艺等方面,对γ-亚麻酸发酵作了相应的研究。
经过对GLA代谢途径的研究,确定了选育高产菌株的方法-抗性筛选法,并确定了筛选培养基的配方:PDA+600mg/L失水苹果酰肼,因为失水苹果酰肼是脂肪酸脱氢酶的抑制剂。在对原始菌株进行复壮、培养、筛选后,讨论比较了紫外线诱变,紫外线复合氯化锂诱变,氮离子注入诱变三种方法对原始菌株的诱变性,统计三种方法对菌种的生物学效应。将筛选出来的高产菌株作为进一步诱变筛选的出发菌株。在氮离子注入诱变过程中筛选到一株稳定的高产菌株,GLA产量增加了8.24%,将它命名为N200-5,作为进一步诱变筛选的出发菌株。
在此基础上,重点讨论氮离子注入诱变γ-亚麻酸生产菌的生物学效应。利用氮离子,在不同能量以及不同剂量下对菌种进行诱变,摸索低能离子与其互相作用规律,统计诱变效应,得到了较高的突变率和较广的突变谱。通过进行大量的筛选工作,确定了氮离子注入的最佳方法:注入能量为10KeV,注入剂量为150×1013ions/cm2~200×1013 ions/cm2。经过诱变后,筛选得到两株稳定的高产突变菌株(S)N10KeV3-3-2和(S)N10KeV3-3-15,产量比出发菌株分别提高了24.46%和25.12%。
在发酵接种量为15%、pH为6.5、装量为100mL(500mL,三角瓶)时,且在发酵基本培养基中添加2.0%花生油、0.5%柠檬酸/柠檬酸三钠(1:1)、0.01%FeSO4、0.002%CuSO4、0.002%MnSO4时,发酵得到的GLA的含量最高,为1.75g/L。同时,通过研究高产菌株菌体形态和GLA之间的关系发现,只要菌体形态呈球形、大颗粒或凝集状,最终GLA含量都会相应较低。