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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难的高度传染性疾病。目前PRRS呈全球流行,这不仅给养猪业造成巨大的经济损失,而且也严重危害养猪业的健康发展。PRRSV之所以能够成功感染宿主并形成持续性感染,是因为PRRSV能够抑制或逃逸宿主先天性免疫和获得性免疫系统,尤其是PRRSV能够抑制I型干扰素(Type Ⅰ IFNs,IFN-I)的产生。因此,深入研究PRRSV免疫抑制和持续性感染的机制,将会为PRRS防控提供理论依据。MicroRNAs(miRNAs)是一类转录后调控基因表达的非编码小RNA,大量研究表明,miRNA通过靶向病毒基因组或调控宿主抗病毒反应,从而影响病毒的复制。已有研究表明,宿主miRNA表达谱的失衡可能与PRRSV引起的免疫抑制和持续性感染有关,然而,目前对PRRSV如何调控宿主miRNA表达的机制和宿主miRNA帮助病毒复制的机制尚不清楚。因此,本研究首先利用RNA高通量测序技术(RNA-Seq)发现PRRSV感染显著改变了MARC-145细胞miRNA表达谱,其中,以miR-373的表达量变化较为明显,进一步的荧光定量PCR(q RT-PCR)方法确证了PRRSV感染明显上调了MARC-145细胞中miR-373的表达量,那么PRRSV是如何上调miR-373的表达以及miR-373对PRRSV复制有何影响及其机理又是什么?本论文针对以上科学问题进行了详尽的研究,具体结果如下:PRRSV通过上调Sp1的表达而促进miR-373的转录。miR-373启动子截断、启动子序列的生物信息学分析和突变实验表明,Sp1(specificity protein 1,Sp1)是miR-373基因的重要转录因子,而EMSA和Ch Ip确证了Sp1能够直接与miR-373启动子结合。进一步实验发现PRRSV感染MARC-145细胞后,Sp1被明显上调,而Sp1 si RNA能明显抑制PRRSV对miR-373的上调表达,相反,过表达Sp1有助于PRRSV上调miR-373的表达,这表明PRRSV可以通过上调Sp1的表达而促进miR-373的转录。通过过表达病毒蛋白和启动子报告质粒等实验,发现PRRSV的非结构蛋白nsp9和结构蛋白N能够明显上调miR-373启动子活性和表达,而且nsp9和N蛋白也能促进Sp1的表达,这表明PRRSV通过nsp9和N蛋白上调Sp1的表达,进而促进miR-373转录。miR-373通过负向调控IFN-I信号通路而促进PRRSV复制。miR-373模拟物和抑制剂转染实验表明,转染miR-373模拟物的MARC-145细胞和PAMs其PRRSV载量明显增加,而miR-373抑制剂却明显抑制了PRRSV复制,这表明miR-373能够促进PRRSV复制。进一步研究发现Sp1能够明显促进PRRSV复制,而且这种促进作用是依赖于miR-373的表达。miR-373靶基因的筛选和鉴定结果表明,NFIA、NFIB、IRAK1、IRAK4、IRF1和IRF9是miR-373靶基因,由于IRAK1,IRAK4,IRF1是参与IFN-I产生的必需信号蛋白,且进一步研究结果表明miR-373可以抑制IFN-β的产生。因此,miR-373可以通过靶向IFN-I信号转导通路中关键分子NFIA、NFIB、IRAK1、IRAK4、IRF1和IRF9而抑制IFN-I信号转导通路,从而促进PRRSV复制。NFIA和NFIB促进IFN-I的产生和抑制PRRSV的复制。过表达NFIA和NFIB蛋白能够增强IFN-β启动子活性和表达水平,而下调NFIA和NFIB后可以抑制IFN-β启动子活性和表达水平,这表明NFIA和NFIB可能调控着IFN-β启动子活性和表达。随后的EMSA和Ch IP结果表明,NFIA/NFIB能与IFN-β启动子结合,以上结果表明NFIA和NFIB可能是IFN-β的转录因子进而能够调控IFN-β的转录表达。此外,过表达NFIA和NFIB后能够抑制PRRSV的复制,而下调NFIA和NFIB则可以促进PRRSV的复制,这表明NFIA和NFIB是可以抑制PRRSV复制的抗病毒蛋白。本研究首次发现NFIA和NFIB能够抑制RNA病毒(PRRSV)的复制。综上所述,本论文阐述了PRRSV调控并利用miR-373逃逸IFN-I抗病毒免疫反应,以及首次发现NFIA和NFIB能够调控IFN-I的产生和拮抗PRRSV的复制。本研究的结果对阐明PRRSV引起免疫抑制和持续性感染机制有着重要的参考意义,也为PRRS的防治研究提供新靶点。