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脑卒中是世界范围内引起高致死率,高致残率的一种疾病,严重威胁着人类的健康。线粒体功能障碍目前被认为是脑卒中后神经元死亡的重要标志之一。研究发现脑卒中后线粒体从星形胶质细胞向受损伤的神经元转移从而启动内源性神经保护机制。基础与临床研究表明浅低温对脑缺血损伤后的神经元具有明确的保护作用,但是浅低温对线粒体从星形胶质细胞向受损伤的神经元转移的影响尚不清楚。因此,本课题旨在研究浅低温是否可以促进线粒体从星形胶质细胞向缺血损伤的神经元转移,加强其内源性神经保护作用。第一部分大鼠星形胶质细胞,神经元细胞原代培养及神经元氧糖剥夺/复氧复糖损伤模型的建立目的:培养原代SD大鼠星形胶质细胞,神经元细胞及建立神经元细胞氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)损伤模型。方法:取24 h内新生SD乳鼠大脑皮层培养原代星形胶质细胞及神经元细胞。其中,星形胶质细胞用10%FBS+DMEM/F12+1%PS培养基进行培养,7 d左右细胞铺满培养瓶底80%以上时进行纯化与传代,待第二代细胞铺满培养板底部90%以上时采用细胞免疫荧光法对其进行纯度鉴定。神经元培养使用97%Neurobasal+2%B27+1%PS无血清培养基,待培养至7-11 d左右时,采用细胞免疫荧光法对其进行纯度鉴定。神经元细胞培养成熟后采用三气培养箱,联合无糖DMEM建立神经元细胞OGD/R损伤模型,氧糖剥夺1 h,复氧复糖24 h。通过光镜下肉眼观察、Hoechst-PI染色以及CCK-8试剂盒对OGD/R损伤模型进行评价。结果:1.新生SD大鼠皮层星形胶质细胞,神经元细胞形态典型,分别用GFAP和MAP2免疫荧光鉴定两种细胞,星形胶质细胞纯度95%以上,神经元纯度90%以上。2.显微镜结果显示,对照(Ctrl)组神经元细胞胞体饱满,折光性强,突起相互交织形成稠密的神经网络;OGD组神经元细胞胞体水肿变圆,折光度差,树突和轴突减少或断裂,神经网络样结构受损。3.CCK8检测结果显示,与Ctrl组相比,OGD/R组神经元活性明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。4.Hoechst-PI染色结果显示,Ctrl组神经元胞核呈均匀蓝色荧光,形态规则;与对照组相比,OGD/R组死亡细胞明显增多,细胞核呈红色,染色质固缩。结论:1.体外培养的新生SD大鼠皮层星形胶质细胞及神经元细胞形态典型,纯度分别为95%和90%以上,可以满足进一步的实验要求。2.神经元细胞OGD/R损伤模型造模成功。第二部分浅低温促进线粒体从星形胶质细胞向氧糖剥夺/复氧复糖损伤神经元的转移目的:研究浅低温(33℃)对线粒体从星形胶质细胞向OGD/R损伤神经元细胞转移的影响。方法:星形胶质细胞,神经元细胞培养及OGD/R损伤模型的建立同第一部分。1观察浅低温对星形胶质细胞线粒体释放的影响。(1)常温组(Normal):星形胶质细胞传代后,待细胞长至铺满培养板底部90%以上时,继续在正常培养箱(37℃)培养24 h。(2)浅低温组(Hypothermia):星形胶质细胞传代后,待细胞长至铺满培养板底部90%以上时,将细胞转移至低温(33℃)培养箱继续培养24 h。收集两组细胞外培养基测定其细胞外ATP含量。2观察浅低温对线粒体从星形胶质细胞向OGD/R损伤神经元转移的影响。2.1激光共聚焦显微镜观察浅低温对线粒体从星形胶质细胞向OGD/R损伤神经元转移数量的变化。(1)常温组(Normal):神经元细胞OGD损伤1 h后加入星形胶质细胞常温培养基复氧复糖24 h。(2)浅低温组(Hypothermia):神经元细胞OGD损伤1 h后加入星形胶质细胞浅低温培养基复氧复糖24 h。免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜观察线粒体转移情况。2.2观察浅低温对线粒体从星形胶质细胞向OGD/R损伤神经元转移的线粒体功能的影响。(1)对照(Ctrl)组:正常培养的神经元细胞。(2)OGD/R组:神经元细胞OGD损伤1 h后换回正常培养基复氧复糖24 h。(3)常温(ACM+OGD/R)组:神经元细胞OGD损伤1 h后将培养基改为星形胶质细胞常温培养基复氧复糖24 h。(4)浅低温(HACM+OGD/R)组:神经元细胞OGD损伤1 h后将培养基改为星形胶质细胞浅低温培养基复氧复糖24 h。Cell-titer-Glo试剂盒检测各组神经元内ATP含量,JC-1染色试剂盒检测各组神经元线粒体膜电位变化。2.3观察浅低温对线粒体从星形胶质细胞向OGD/R损伤神经元转移神经元活性及存活率的影响。(1)对照(Ctrl)组:正常培养的神经元细胞。(2)OGD/R组:神经元细胞OGD损伤1 h后换回正常培养基复氧复糖24 h。(3)浅低温(HACM+OGD/R)组:神经元细胞OGD损伤1 h后将培养基改为星形胶质细胞浅低温培养基复氧复糖24 h。(4)浅低温正常(HACM+N)组:正常培养的神经元细胞培养基改为星形胶质细胞浅低温培养基继续培养24 h。(5)常温(ACM+OGD/R)组:神经元细胞OGD损伤1 h后将培养基改为星形胶质细胞常温培养基复氧复糖24 h。(6)常温正常(ACM+N)组:正常培养的神经元细胞培养基改为星形胶质细胞常温培养基继续培养24 h。CCK8试剂盒检测各组神经元活力。Hoechst-PI染色检测各组神经元的死亡率。结果:1.与常温组相比,浅低温组细胞外ATP含量明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。2.与常温组相比,浅低温组星形胶质细胞转移至OGD损伤神经元的线粒体明显增多。3.与Ctrl组相比,OGD/R组神经元内ATP含量明显减少(P<0.01),线粒体膜电位明显降低,JC-1染色呈高绿低红;与OGD/R组相比,HACM+OGD/R组和ACM+OGD/R组神经元内ATP含量明显增加(P<0.01),线粒体膜电位显著增高,JC-1染色呈高红低绿;与ACM+OGD/R组相比,HACM+OGD/R组神经元内ATP含量增加(P<0.01),线粒体膜电位增高,JC-1染色显示更多的是以红色聚合体形式存在,染色更深。4.与Ctrl组相比,OGD/R组神经元活性明显降低(P<0.01),死亡率明显增高(P<0.01);与Ctrl组相比,HACM+OGD/R组和ACM+OGD/R组神经元活性稍有增高,死亡率稍有降低但无统计学差异(P>0.05);与OGD/R组相比,HACM+OGD/R组和ACM+OGD/R组神经元活性明显增高(P<0.01),死亡率明显降低(P<0.01);与ACM+OGD/R组相比,HACM+OGD/R组神经元活性明显增高(P<0.01),死亡率显著下降(P<0.01)。结论:浅低温促进了线粒体从星形胶质细胞向OGD/R损伤神经元的转移,加强了其内源性神经保护作用。