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豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)是一种重要的刺吸式害虫,其分泌的唾液对取食寄主植物和传播植物病毒有重要的作用。RNA干扰(RNAi)作为一种特异性抑制体内基因表达的机制,其技术已成为研究昆虫基因功能的主要方法之一。豌豆蚜相关基因组序列的公布,为蚜虫的生物学和应用研究提供了条件。为了探讨蚜虫唾液蛋白的功能,本研究建立了豌豆蚜的显微注射技术体系,利用RNA干扰技术探索蚜虫唾液腺基因的功能；另外,对豌豆蚜唾液腺的一个未知功能基因家族做了深入研究。现将主要研究内容和结果总结如下：1)豌豆蚜唾液腺基因信息分析根据文献资料,通过NCBI,BCM, ExPASy Proteomics Server, Splign, Reverse Complement等5个网站分析豌豆蚜唾液腺中特异性表达的43个蛋白。其中8个蛋白功能已知,5个蛋白正在被研究；其中有12个是多拷贝基因,多拷贝之间的同源性在21%-99%之间不等；剩余的23个蛋白的基因是单拷贝,部分基因ORF不完整。2)豌豆蚜RNAi向3龄豌豆蚜的若蚜体内注射不同浓度(3.4.5、6μg/μL) GFP的dsRNA,观察三种浓度下豌豆蚜的存活曲线没有差异。为保证干扰的效果,选择高浓度的dsRNA,即6μg/μL,注射体积为23nL。Contig3291, Contig3357, Contig3169, Contig3302这四个基因在注射dsRNA后的第1d存活率就比对照组显著降低,而Contig10169在注射dsRNA后第3d才与对照组的存活率有差异。采用比较Ct值的相对定量法(2-△△Ct法)计算了干扰后各基因的相对表达量：与对照组相比,Contig3357的dsRNA注射后1d和3d有显著差异,干扰率分别为38.69%+10.33和34.44%+6.157；Contig3291的dsRNA注射后1d、2d、3d三天均有显著差异,干扰率分别为49.8%±6.14、28.1%±4.93、45.1%±8.44；Contig3169的dsRNA注射后2d有显著差异,干扰率为67.1±7.13%；Contig3302的dsRNA注射后3d有显著差异,干扰率为34.9%±11.8；Contig10169的dsRNA注射后1d和3d有显著差异,干扰率分别为55.28%±5.644和54.66%±9.806。这些数据说明在3龄若蚜体内注射dsRNA能够降低目标基因的转录水平。3)豌豆蚜唾液腺未知功能蛋白家族的时空表达克隆了在豌豆蚜唾液腺高表达的一个未知功能的蛋白家族,该家族包括13个基因,编码14种蛋白,其中4个基因在唾液腺高表达。这个家族是蚜虫特有的蛋白家族,富含半胱氨酸,14个半胱氨酸是保守的,其中的6个半胱氨酸形成三个CXXC结构域。用半定量逆转录PCR检测了每个成员在豌豆蚜不同发育阶段和不同组织间(脑、唾腺、消化道、卵巢)的表达,结果显示这个家族没有发育阶段特异性,而有组织特异性。推测这个家族可能具有氧化还原酶或DNA甲基化酶的功能。本研究建立起的RNAi体系,不仅可用来研究豌豆蚜基因的功能,而且也丰富了害虫控制理论中该项技术的应用,为害虫控制研究了提供新的途径和方法。克隆的未知功能蛋白家族包含了几个在唾液腺中高表达的基因,这几个蛋白序列含有信号肽,有可能是蚜虫唾液重要的组成成分。作为一类危害农作物的主要害虫,刺吸式害虫的防治一直是农业领域的研究热点和难点,对其唾液成分的鉴定及功能研究,可为防治刺吸式害虫提供新的思路和方法,如通过干扰唾液腺重要蛋白的表达来抑制蚜虫的取食或传毒。