目的：缺血性心脏病是是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。心脏衰竭最终导致冠状动脉疾病。心脏病最常见的死因主要是很多心脏病患者会发生急性心肌梗死。急性心肌梗死的特征是突然的冠状动脉闭塞，并导致氧气供应不足（缺血），不可逆的肌肉损伤，心肌坏死。心脏的缺血随后会启动个重构的程序，其包括在幸存细胞代谢的修饰，左心室结构的一系列改变：心脏的肥大、纤维化和心室的扩张。这些改变都伴随着一个对心脏不利的因素，并逐渐导致心脏代偿功能失调和进行性心力衰竭。骨髓间充质干细胞表现出多向分化潜能，各种干细胞可以从骨髓，脂肪组织，脐带血，外周血中发现并分离出来。比如胚胎干细胞，骨髓来源的骨髓间充质干细胞（MSCs）有广泛的自我扩增能力，在合适的微环境下能分化成多种细胞：心肌细胞、神经细胞、成骨细胞、平滑肌细胞。在MSCs移植后，MSCs分泌的可溶性因素在心肌梗死后的心肌修复中起着非常重要的作用。MSCs的移植已显示可以预防急性心肌缺血性损伤，而且可以通过促进保护性细胞因子的释放以促进血管的再生。再者，最近的研究表示：缺血性心脏的干细胞移植会通过免疫抑制行为产生保护性作用。该研究也显示MSCs的潜在刺激因素是一种新颖的心脏修复机制。总之，越来越多的动物实验和临床实验证实了通过抑制细胞凋亡，免疫抑制，血管再生，分化等，MSCs移植改变了心脏的功能。然而，没有证据表明MSCs是否能防止心脏细胞的早衰。许多研究已经证实自体和异体MSCs的移植对于急性心肌损伤有很大的改善。因此，MSCs通过在不同培养条件下分化为各种不同的细胞，包括血管平滑肌细胞，内皮细胞和心肌细胞，从而减弱了心肌的损伤。同样也有资料显示MSCs产生的营养物质能够通过这些物质的联合作用改进心脏的功能，包括减少炎症，刺激宿主干细胞，减少血管再生和纤维化的重构。所以，MSCs能够而且通过替代病变的心肌细胞，提供大量的抑制细胞凋亡和促有丝分裂因子来改善心脏的损伤。许多实验已研究了对乳鼠心肌细胞（cardiomyocyte,CM）的原代培养的方法。在体外分离，培养的心肌细胞，不但可以保持原来结构和功能，乳鼠的心肌会提供一个简单的实验系统。与成年的心肌细胞相比，乳鼠心肌细胞具有分裂能力，适于培养，而且适合于进行非病毒基因的转染。NKX2.5是NK型同源盒基因家族NK2型的成员, NKX2.5对早期心肌的分化、整个心管的形成与环化起重要作用，且参与房室分隔、传导系统及成熟心脏正常功能的维持,因此也成为心脏发育过程中最重要的转录因子。NKX2-5在早期心脏组细胞中有很高的表达，在小鼠胚胎的发生和成年心脏中有高水平持续表达。尤其是，在转导系统形成时期，NKX2-5基因在特殊的心脏转导细胞显示出瞬时表达提高。微环境由两方面组成：细胞周围影响能够细胞兴奋、抑制活动的微环境的因素;该细胞自身在分化过程中形成的特殊结构和受体。细胞的反应决定于微量因素质与量,和自身相关部位的机能状态，这两方面共同产生的综合效应,其相互影响、相互协调,使细胞生长、增殖和定向分化能够适应机体需要。MSCs同样处于这种互动的促进式的微环境的调控下,包括来源于:心肌细胞自身的理化因素，以及由自身分化所形成的感应外界的结构。有研究者将周围环境中的理化因素化分为直接因素，间接因素。前者是指对MSCs所产生各种外部刺激、以及一些离子、小分子物质的作用，这些物质都是通过“通道”进行传递的;后者是指分泌的各种可溶性可供MSCs利用的因子。现在的组织工程技术主要是利用靶细胞和生物学的材料，用以研究和探讨组织和器官的再生的问题。但是当前面临的问题是在移植这些材料后，如何促进血管的再生和重构，以及机体能不能耐受这种外界的物质的问题。如今骨髓内皮祖细胞和骨髓间质干细胞的共培养已经等到广泛的应用。已有实验研究表明向骨髓间充质干细胞中转染NKX2-5基因，单纯通过基因的瞬时表达诱导其向心肌样细胞分化，通过诱导MSCs细胞分化成心肌样细胞。本研究利用脂质体转染法将NKX2-5基因瞬时转染SD的MSCs，观察其在与心肌共培养的条件下向心肌分化的情况，并与单纯经NKX2-5转染后的MSCs向CM分化的情况作比较，通过研究探讨心肌细胞在分化过程中具有的一些特征性的规律，为干细胞作为靶细胞治疗心肌疾病提供实验依据。方法：1PEGFP-N1-NKX2-5真核表达质粒的激活与扩增科室保存的含有PEGFP-N1-NKX2-5质粒的大肠杆菌DH5α感受态细菌，涂布于含卡那青霉素的LB固体培养基上，在37℃恒温箱中倒置培养12-16h；挑取单个克隆的菌落,进行下一步的扩增。用质粒小提抽提试剂盒提取质粒，并检测其浓度。2SD大鼠的MSCs的体外分离、纯化、扩增取SD大鼠的胫骨和股骨中的骨髓组织，分离纯化出MSCs。将其放置于胎牛血清浓度为10%的L-DMEM/F12的完全培养基中，第3天换液，以后每3天换液一次，等到细胞爬满瓶底是转代。取第二代MSCs做后续试验。3乳鼠CM的分离、培养、鉴定取出生3天以内的SD大鼠的乳鼠，用75%酒精来消毒皮肤，开胸取出心室肌组织,并在体外将其剪成体积为1mm~3的小组织块,用配好的消化组织的胰酶消化，直至组织消化完全，收集消化液过滤、离心、重悬后，通过差速贴壁一次和加入0.1mmol/LBrdu来纯化心肌细胞。48h后换去含Brdu的培养基，以后隔天换液，倒置显微镜观察细胞变化。取第5天的心肌细胞做后续试验。4PEGFP-N1-NKX2-5真核表达质粒转染MSCs转染之前通过预实验确定合适的细胞接种密度，转染最佳体系。本实验采用阳离子转染试剂Lipofectamine2000将质粒NKX2-5-PEGFP转染MSCs，于转染后6h利用荧光显微镜观察NKX2-5-PEGFP融合蛋白在MSCs中的表达。5转染NKX2-5基因的MSCs细胞和乳鼠心肌细胞共培养将4×10~5/mL的乳鼠心肌细胞与1×103/mL转染NKX2-5基因的MSCs细胞共培养作为第1代，本实验分为共培养组和未共培养组，共培养组为瞬时转染NKX2-5基因的MSCs和心肌细胞共培养；未共培养组为单纯转染NKX2-5的MSCs细胞。在培养后的15d收集细胞，而且进行传代，作为第2代，再培养后的15d收集细胞，再进行传代，作为第3代，在培养后的15d收集细胞，以免疫细胞化学法检测心肌肌钙蛋白T（cTnT）在MSCs中的表达和HE染色法观察F1，F2，F3细胞的形态和蛋白表达。6统计学分析：采用SPSS13.0统计软件进行统计，所有数据用均数±标准差（x±s）表示，采用配对t检验的统计分析方法，检验水准取α=0.05，当P <0.05时认为有显著差异。结果：1原代MSCs细胞接种24h后,细胞是主要以克隆的方式增殖。观察到有少许细胞贴壁于培养瓶底，细胞形态多呈梭形，纺锤形，也有部分细胞成纤维样，开始有增殖，聚集生长。培养至第3天，绝大多数细胞均以贴壁，培养至第7天，相邻细胞达到90%的融合，大致分为三种形态：长梭形，多边形，小圆形。传代后于48h完全贴壁，约5天融合成片，第2代以后，细胞形态开始呈较均一的长梭形，细胞排列呈明显的漩涡状，或者辐射状。2培养3天后心肌细胞呈梭形、多角形等不规则形态，伸出突起相互连接交织成网，并出现搏动，频率多为70-150次/分。心肌细胞2~3h左右贴壁后，细胞开始伸出伪足,变为菱形或者多角形,出现规律性的搏动,频率不等50~140次/分,2天后细胞逐渐在培养瓶的瓶壁的表面展开,3~4天细胞逐渐伸出原生质的突起，并互相接触交织呈网状。3转染6h后用荧光显微镜观察到：转染组PEGFP-NKX2-5融合蛋白在MSCs中有绿色荧光表达，可见细胞内有绿色的荧光，细胞核和细胞质均存在；而非转染组的MSCs细胞核和细胞质中均未见绿色荧光的表达。4HE染色观察：有的细胞呈聚集生长，呈细胞团，细胞团之间还可见存在散在的细胞，多呈长梭形，细胞的形态较均一。5细胞共培养第1代（F1），第2代（F2）,第3代（F3），共培养组与未共培养组用免疫细胞化学法均可分别检测到心肌肌钙蛋白T（cTnT）在MSCs中的表达，且F2表达量比F1表达量高，F3表达量比F2，F1表达量高，各个时间点相比有显著性差异（P <0.05）。共培养组与未共培养组相比，在F1，F2，F3三个时间点，共培养组cTnT基因的表达量均比未共培养组高。统计分析结果显示：共培养组F1，F2，F3时cTnT的表达量均高于未共培养组，三者相比有显著差异（P＜0.01或P＜0.05）。结论:1乳鼠心肌细胞的纯化，采用差速贴壁1h后加入Brdu的方法，抑制成纤维细胞的分裂增殖，可提高心肌细胞的纯度。2与心肌细胞共培养的外源转染表达NKX2-5基因的MSCs向心肌分化的情况优于未共培养组的MSCs细胞，说明转录因子NKX2-5可以促进MSCs向心肌分化，在蛋白水平表达心肌标志物和早期转录因子，而且表明机械力的牵拉作用可有效促进MSCs细胞向心肌细胞分化。3与心肌细胞共培养方法，可在体外模拟心肌微环境诱导MSCs细胞向心肌细胞定向分化，表达心肌细胞特异cTnT，且表达量随培养时间延长而逐渐增高。